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抗HER-2加抗CD3双特异抗体抑制胃癌细胞生长的实验研究
目的 探讨基因工程抗HER-2+抗CD3双特异抗体(bispecific antibody,BsAb)对表达人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)的人胃癌细胞体外及体内生长的影响.方法 用MTT方法测定Herceptin、抗CD3和BsAb抗体对胃癌细胞系SGC-7901的抑制率;免疫细胞化学法检测SGC-7901细胞的HER-2表达水平;建立裸鼠模型,将HER-2+CD3 BsAb与效应细胞(正常人外周血淋巴细胞)联合应用,观测各组荷瘤动物的肿瘤生长状况.结果 正常对照组、抗CD3单克隆抗体联合效应细胞、Herceptin联合效应细胞及HER2+CD3 BsAb联合效应细胞肿瘤细胞的生长抑制率分别为0、(24.3±1.2)%、(56.2±2.6)%、(91.3±4.1)%各组荷瘤裸鼠与对照组的肿瘤体积为(0.86±0.02)cm3、(0.52±0.04)cm3、(0.20±0.06)cm3、(0.11±0.02)cm3,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),其中HER-2+CD3 BsAb联合效应细胞的抑制作用更为显著,与抗CD3 McAb联合效应细胞、Herceptin联合效应细胞组相比差异也有统计学意义(P＜0.05).结论 HER-2/neu是胃癌免疫治疗的有效靶点,基因工程抗HER-2+抗CD3 BsAb在体外及体内均具有有效的抗肿瘤活性.
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阿糖胞苷联合双功能抗体介导T细胞杀伤人急性B淋巴细胞白血病细胞体内外研究
目的:通过体内外实验探讨阿糖胞苷对抗CD3/抗CD19双功能抗体介导的T淋巴细胞杀伤人急性B淋巴细胞白血病(B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)细胞的协同作用.方法:采用流式细胞术检测经阿糖胞苷(0.062 5、0.125、0.25、0.5μmol/L)刺激的Nalm-6细胞(1×106)及5例B-ALL患者临床标本CD80和CD86分子的表达;Ficoll-Hypaque法分选健康志愿者外周血T淋巴细胞,以4×105 Nalm-6细胞(经过或未经Ara-C刺激)为靶细胞,建立T细胞体外杀伤实验并分组加入各种抗体(PBS、抗CD3/抗CD19双抗、抗CD3scFv、抗CD19scFv、抗CD3scFv+抗CD19scFv和抗CD3/抗PgP双抗组),通过实时定量PCR测定各组激活的T细胞细胞因子IL-3、IFN-γ和TNF-α的表达,利用流式细胞术检测各组T细胞穿孔素和颗粒酶B的释放.以1×107 Nalm-6细胞建立NOD/SCID鼠移植瘤模型,依次注射阿糖胞苷,T细胞及各种或各浓度抗体,比较各组体内靶向杀伤效果.建立临床标本的动物模型,重复上述分组,并进一步验证双抗联合阿糖胞苷介导的体内杀伤效果.结果:Nalm-6经阿糖胞苷刺激后,细胞CD80的表达量MFI为13.25±3.93,0.062 5 μmol/L为20.58±3.94,P=0.015;0.125μmol/L为38.6±5.37,P=0.011;0.25 μmol/L为62.56±6.24,P=0.007;0.5 μmol/L为75.04±4.42,P=0.005,呈浓度依赖性.抗CD3/抗CD19组T淋巴细胞穿孔素(MFI为10.61±2.43,P=0.024)和颗粒酶B(MFI为20.60±2.61,P=0.037)的释放较其余各实验组明显升高,Ara-C刺激Nalm-6细胞组,穿孔素(MFI为23.11±2.90,P=0.015)和颗粒酶B(MFI为31.71±3.08,P=0.008),较未经Ara-C刺激组表达量高.抗CD3/抗CD19组T淋巴细胞IL-3(100.60±8.32,P=0.017)、IFN-γ(67.60±7.41,P=0.025)和TNF-α(47.60±3.24,P=0.031)表达对照T细胞组明显升高,并且Ara-C刺激Nalm-6细胞组IL-3(132.55±5.56)、IFN-γ(109.60±6.50)和TNF-α(64.30±8.55)较未经Ara-C刺激组表达量更高,P值均＜0.05.在NOD/SCID鼠移植瘤模型的生物治疗实验中,阿糖胞苷联合双功能抗体组抑制移植瘤的生长效果较对照组明显增强,P＜0.05.5例临床标本阿糖胞苷刺激后有2例CD80表达上调,体内实验中该2例标本体内移植瘤生长受到明显抑制,P＜0.05.结论:阿糖胞苷通过上调Nalm-6细胞和部分B-ALL患者临床标本共刺激分子CD80的表达,可有效激活T细胞,并增强双功能抗体介导T细胞体内杀伤细胞的作用.
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抗EGFR-抗CD3双功能抗体介导CIK细胞、LAK细胞或PBLS细胞对胃癌荷瘤裸鼠治疗效果的比较
目的 比较抗EGFR-抗CD3双功能抗体在体内条件下介导CIK细胞、LAK细胞及人类PBLS细胞三类不同的免疫效应细胞对胃癌细胞的杀伤能力,为临床应用该抗体治疗胃癌的细胞选择提供实验指导.方法 采用化学耦联法合成的抗EGFR-抗CD3双功能抗体分别与CIK细胞、LAK细胞及人类PBLS细胞联合经尾静脉注入SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠体内,同时以等量0.9％NaCl溶液尾静脉注射建立对照,治疗后检测在体情况下4组对胃癌细胞的杀伤能力,进行组间比较.结果 抗EGFR-抗CD3双功能抗体介导CIK细胞治疗组小鼠肿瘤抑制率为(64.9±7.7)％,显著高于抗EGFR-抗CD3双功能抗体介导LAK细胞及人类PBLS细胞组的(43.5±8.2)％和(39.7±6.5)％(均P＜0.05),治疗结束时平均肿瘤质量为(473.9±37.7)mg,显著低于其他两组的(764.6±88.3) mg和(829.1±104.4) mg(均P＜ 0.05).结论 初步的裸鼠模型治疗实验显示由抗EGFR-抗CD3双功能抗体介导的CIK细胞在体内条件下对胃癌治疗作用优于其他常用的免疫效应细胞.
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基因工程双特异性抗体构建模式研究进展
为了增强抗体的效应功能,人们尝试多种方法改造抗体分子,双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一,现已成为抗体工程研究领域的热点.随着分子生物学技术的迅速发展,出现了基因工程双特异性抗体的多种构建模式,并且有多种基因工程双特异性抗体制剂已经用于肿瘤的临床诊断和治疗试验.本文对基因工程双特异性抗体的构建模式按照双特异性微抗体、双链抗体、单链双特异性抗体和多价双特异性抗体4类进行了综述.
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卵巢癌抗独特型单链抗体诱导特异性体液免疫应答的动物实验研究
目的:用卵巢癌抗独特型单链抗体6B11 scFv代替肿瘤抗原免疫动物,观察是否诱导动物产生特异性体液免疫反应.方法:将6B11 scFv交联钥孔虫戚虫血蓝素,辅以弗氏佐剂反复免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.采用间接法ELISA,竞争抑制ELISA及免疫流式细胞法分析抗血清特性.结果:经ELISA检测显示,由6B11 scFv刺激产生的抗-抗独特型单链抗体(Ab3)能与6B11 scFv和卵巢癌组织抗原OC166-9特异性结合.竞争抑制ELISA表明,Ab3能有效抑制卵巢癌单抗COC166-9(Ab1)与OC166-9的特异性结合.免疫流式分析结果可见, Ab3能与表达卵巢癌抗原的人卵巢癌细胞系OV1细胞表面结合而不能与无卵巢癌抗原表达的人宫颈癌细胞系HeLa细胞表面结合.从以上结果可以证明Ab3与Ab1的抗原结合特性相同.结论:6B11 scFv能代替卵巢癌抗原诱导动物产生特异性体液免疫反应,具有模拟抗原的作用,为6B11 scFv作为卵巢癌抗独特型单链抗体疫苗的实际应用提供依据.
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治疗恶性肿瘤的新方法--双特异性抗体的研究
长期以来肿瘤的临床治疗一直受到三大难题的困扰:常规的放/化疗方案选择性较差;肿瘤细胞产生耐药性;肿瘤发生微小转移.肿瘤的免疫治疗无疑为解决这些难题提供了一条新途径,其中,能靶向肿瘤细胞的双特异性抗体疗法因具有较好的临床应用前景,现已成为这一新途径中的研究热点之一,并使得"肿瘤的导向治疗"更加接近实现.
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抗血小板膜糖蛋白Ⅰbα/Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究
目的构建、表达抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰbα/GPⅢa双特异单链抗体,为其进一步研究、应用奠定基础.方法应用PCR技术,扩增出接头片段和SZ-21单链抗体基因,克隆入pUCm-T载体,测序分析.应用基因重组技术将接头片段、SZ-21单链抗体基因和SZ-2单链抗体基因重组拼接,构建SZ-2/SZ-21双特异单链抗体表达载体pET22-21-L-2scFv,并测序验证.导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys,诱导表达.流式细胞术、ELISA、Western blot检测SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合能力,瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究.结果表达载体pET22-21-L-2scFv构建拼接正确;表达产物以包涵体形式为主,表达量占菌体总蛋白的14%;经变性、纯化、复性,表达产物具有与血小板以及血小板GPⅠbα和Ⅲa结合活性,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集并呈剂量依赖性.结论成功表达了SZ-2/SZ-21双特异单链抗体,该抗体具有与相应2个靶抗原结合活性,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集.
关键词： 抗体 双特异性 血小板糖蛋白GPIIb-IIIa复合物 -
抗P-gp/抗CD3双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病耐药细胞
目的研究抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体介导T细胞对白血病耐药细胞的特异性靶向杀伤活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot及活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物;采用人白血病耐药及敏感裸鼠移植瘤模型测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性.结果纯化的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体具有与Jurkat(CD3阳性)和K562/A02细胞(P-gp阳性)的结合活性,结合阳性率分别为86.25%,86.26%;在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体能有效抑制耐药白血病移植瘤的生长,抑瘤率98.57%.结论抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤表达P-gp抗原的耐药肿瘤细胞,具有潜在的临床应用前景.
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超声微泡联合双特异性抗体对骨髓间充质干细胞干预心肌纤维化的实验研究
目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在超声辐照微泡(MB)和双特异抗体(BiAb)的辅助下干预心肌纤维化的效果及可能机制.方法 在MB的辅助下,将雄性小鼠MSCs与BiAb输入异丙肾性心肌纤维化雌性小鼠(MSCs+BiAb+MB组).BiAb由能识别间充质干细胞的anti-CD29和能特异性结合损伤心肌的抗肌凝蛋白轻链抗体(AMLCA)制备.另设未治疗组、单纯MSCs组、单纯BiAb组、单纯MB组、MSCs+BiAb组和正常对照组.5周后处死小鼠,实时荧光定量PCR检测心肌Y染色体鉴别基因(SRY)的表达.天狼猩红染色对比心脏胶原纤维含量.免疫组织化学染色法观察心脏热休克蛋白-70(HSP-70)表达.结果 MSCs归巢数多的是MSCs+BiAb+MB组,其次为MSCs+BiAb组,MSCs组归巢数少.与未治疗组相比,MSCs+BiAb+MB组、MSCs+BiAb组和单纯MCSs组的心肌胶原纤维含量下降(P＜0.05),HSP-70表达下调(P＜0.05).其中,与单纯MSCs组相比,MSCs+BiAb+MB组的心肌胶原沉积量更低(P＜0.05).单纯MB组、单纯BiAb组与未治疗组的胶原沉积量、HSP-70表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MB可促进骨髓间充质干细胞的归巢,联合BiAb,可进一步增加干细胞的归巢率和修复效果.MSCs归巢后能干预心肌纤维化,其机制可能与HSP-70的介导有关.
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FDA：批准安进公司 Blincyto 用于治疗急性淋巴细胞性白血病
Blincyto 这款药物去年12月成为获得 FDA 批准的首款抗 CD19药物，它也是安进双特异性 T 细胞衔接器（BiTE）抗体项目的主要产品，已被批准用于治疗费城染色体阴性（ Ph-）复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ ALL）。
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新型双靶向全人源抗体在口腔鳞状细胞癌中的应用
目的：发现并探讨新型抗 HER3/ EGFR 双特异性抗体 NB031在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的靶向治疗作用。方法筛选与鉴定双特异性抗体 NB031；MTT 法检测 NB031对 OSCC 细胞增殖的影响；Western Blotting 法检测NB031对下游信号通路的影响；通过建立裸鼠 KB OSCC 模型,比较生理盐水、cetuximab 和 NB031对肿瘤体积的影响。结果 Cetuximab 和 NB031均降低 HSC3和 KB 细胞增殖能力,NB031抑制效果明显大于 cetuximab；与 cetuximab 相比, NB031显著降低 EGFR 和 HER3及它们下游信号的磷酸化；cetuximab 和 NB031均降低肿瘤体积增长速率,NB031作用更明显。结论相比 cetuximab,NB031能够更有效地抑制人 OSCC 细胞生长,是一种具有潜在前景的靶向治疗制剂。
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特异性抗-c 伴类同种抗-e 抗体致配血困难一例
输血是临床治疗贫血的一项有效的治疗方法,输血前患者血型鉴定和交叉配血试验是保障输血安全的重要手段。在人类32个血型系统中,Rh 血型是仅次于 ABO 血型系统的重要而复杂的系统,由于输血或疾病本身可能产生不规则抗体,从而引起输血反应或配血不合在临床输血中较常见[1-2]。近期在临床患者血液标本中发现1例罕见的由于反复输血和服用药物而产生了特异性抗-c 抗体,同时伴有类同种抗-e 抗体,现报告如下。
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美批准全球首个双特异性抗体药物上市
美国食品和药品监督管理局（FDA）已批准由安进公司研发的免疫治疗药物BLINCYTO用于费城染色体阴性的复发性或难治性前B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗， BLINCYTO由此成为全球首个获得FDA批准的双特异性T细胞CD3结合CD19靶向抗体药物。
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PTEN表达与肿瘤
PTEN是Steck等3个国际科研小组分别克隆到的一种抑癌基因,是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因.Pten蛋白的主要功能位于N端,符合蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酶催化区的核心基序,并与张力蛋白、辅助蛋白高度同源.本文综述了Pten抑癌基因及Pten表达蛋白的发现、结构、作用机理和目前PTEN的研究进展.
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温莪术提取物协同抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体抑制神经胶质瘤生长
目的:观察具有诱导癌细胞凋亡的作用,并作为免疫调节剂的温莪术提取物β-榄香烯是否可协同抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体免疫抑制胶质瘤生长.方法:实验于2003-12/2005-08在苏州大学附属第二医院脑肿瘤研究室完成.①选用重度联合免疫缺陷SCID小鼠30只,雌雄不拘,鼠龄4～6周.温莪术提取物β-榄香烯由大连市医药科学研究所馈赠.采用化学偶联法将由解放军第二军医大学长海医院免疫室提供的CD3单抗和本室制备的SZ39抗人脑胶质瘤单抗制备为双特异性抗体.②取培养生长的人脑胶瘤体外细胞系SHG-44细胞3×108 L-1,于人外周血单个核细胞转输后次日,直接注射于SCID鼠右腋皮下.将种瘤后SCID小鼠按随机抽签法分为5组:β-榄香烯+抗体+白细胞介素2+单个核细胞组:每天腹腔注射β-榄香烯(1 5 mg/只)和双特异性抗体200μg/只,每天尾静脉注射白细胞介素2(5×105 U/只),接种肿瘤前1天及第14天尾静脉注射人外周血单个核细胞(3.16×1010 L-1,0.5 mL,取自苏州大学附属第二医院健康志愿者2名外周血);抗体+白细胞介素2+单个核细胞组:注射3种物质剂量和方法同上组;白细胞介素2+单个核细胞组:注射2种物质剂量和方法同上组;外周单个核细胞组:注射外周单个核细胞剂量和方法同上组;对照组:尾静脉注射培养液.③记录肿瘤增殖的潜伏期,即接种日至皮下扪及微结节的时间.接种肿瘤28 d后,称肿瘤质量.荧光原位杂交法测算每克肿瘤人淋巴细胞数量.苏木精-伊红染色,Olympus光学显微镜(×200)下观察肿瘤组织病理学变化.结果:SCID小鼠30只均进入结果分析.①神经胶质瘤组织病理学观察结果:β-榄香烯+抗体+白细胞介素2+外周血单个核细胞组和抗体+白细胞介素2+外周单个核细胞组肿瘤细胞有部分坏死,并有淋巴细胞浸润,其余各组形态相近,淋巴细胞浸润相对较少.②肿瘤增殖潜伏期:β-榄香烯+抗体+白细胞介素2+单个核细胞组明显长于其他4组(P＜0.05),抗体+白细胞介素2+单个核细胞组明显长于白细胞介素2+单个核细胞组、外周单个核细胞组和对照组(P＜0.05),白细胞介素2+单个核细胞组明显长于外周单个核细胞组和对照组(P＜0.05).③肿瘤质量:β-榄香烯+抗体组明显高于其他4组(P＜0.01).④肿瘤中人淋巴细胞浸润数量:β-榄香烯+抗体组明显多于其他4组(P＜0.01).结论:温莪术提取物可协同双特异性抗体抑制神经胶质瘤生长.
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抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体的鉴定、免疫活性测定及其对T淋巴细胞的作用
目的:鉴定自制的抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)的双向结合能力,测定其免疫活性及其对T淋巴细胞的作用.方法:用标化凝胶柱洗脱、免疫组化等方法对自制双抗的相对分子质量及双向结合能力进行测定,用酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法对双抗的双向免疫活性及其对T淋巴细胞表型的作用进行测定,并观察T淋巴细胞形态的变化.结果:经洗脱证实该双抗相对分子质量为11万;经双抗作用后,胶质瘤细胞和淋巴细胞阳性染色率分别>80%和>90%;免疫活性测定显示双抗不仅可与T淋巴细胞结合(结合效价为1∶32 000),还可结合胶质瘤细胞(结合效价为1∶8 000);在细胞表型方面,被双抗活化时,CD3+细胞数占绝大多数,CD8+细胞比例随着培养时间的延长逐渐增加.结论:所制备的复合物确系具有双向结合能力的双抗,有双向免疫活性,并可活化T淋巴细胞.
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抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体对人脑胶质瘤生长的影响
目的:研究抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)对裸鼠体内人脑胶质瘤生长的影响.方法:动物分为6组,实验组系双抗治疗组,其余为不同的对照组,采用人脑胶质瘤裸鼠模型NHG-1,分别观察各组中肿瘤的出现、生长及宿主的生存情况.结果:在实验组中,肿瘤出现的平均潜伏期、肿瘤细胞生长周期时间以及动物的生存期均比各对照组延长(P<0.05或P<0.01);肿瘤增殖曲线显示,经几周缓慢生长后,各对照组先后进入快速生长期,而经双抗治疗的实验组,肿瘤始终处于缓慢生长状态.结论:抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体可以延缓人脑胶质瘤在动物体内的生长速度,具有临床应用潜力.
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rIL-2、TNF-α、IFN-γ与抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体的协同细胞毒作用
目的:观察细胞因子rIL-2、TNF-α、IFN-γ对抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)的协同作用,进一步提高双抗对人脑胶质瘤的治疗作用.方法:以人脑胶质瘤细胞株SHG-44为靶细胞,健康人或胶质瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞,以18 h 3H-TdR掺入释放法测定细胞毒活性,采用单比实验和联合作用等对比分析方法,分析各细胞因子(rIL-2、TNF-α、IFN-γ)对双抗诱导的细胞毒性作用的影响.结果:rIL-2、TNF-α、IFN-γ均可协同提高双抗对人脑胶质瘤的细胞毒作用(P<0.05).来源于恶性胶质瘤患者的效应细胞活性较正常人低,rIL-2与双抗可协同增强其活性.结论:细胞因子rIL-2、TNF-α、IFN-γ可协同提高双抗对效应细胞的活化,充分激活效应细胞,增强抗肿瘤免疫能力.
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PTEN基因与肿瘤关系的研究
PTEN基因是新近发现的一个具有双特异性的抑癌基因,其突变失活与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关.PTEN蛋白在细胞的生长发育、信号转导和细胞凋亡过程中起重要作用.以下就PTEN基因与肿瘤的关系作一综述.
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双特异性抗体blinatumomab治疗B淋巴细胞肿瘤的研究进展
双特异性抗体是一种以T细胞作为效应细胞的新型肿瘤免疫治疗分子,由2种单链抗体可变区片段(single-chain variable fragment,ScFv)及中间的柔韧性链接肽组成,因此具有2个特异性抗原结合位点,可同时与T细胞表面白细胞分化抗原3(cluster of differentiation 3,CD3)及靶细胞表面特异性抗原结合,形成免疫突触,无需主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ类分子及共刺激分子参与激活细胞毒性T细胞杀伤肿瘤细胞.Blinatumomab是首个被FDA批准用于临床治疗的双特异性抗体,以CD19作为靶点,因此对B淋巴细胞恶性肿瘤,包括复发/难治B淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤治疗效果显著.本文就双特异性抗体以及Blin-atumomab的结构、作用机制及其在肿瘤治疗中的应用等方面作一综述.
