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人MutS同源蛋白2(hMSH2)过表达的肺癌细胞模型的构建
目的 构建人MutS同源蛋白2(hMSH2)过表达的肺癌细胞模型,探究hMSH2分子介导γδ T细胞杀伤肺癌细胞的效应.方法 PCR扩增hMSH2编码序列,同源重组法构建hMSH2-EGFP融合蛋白过表达载体;转染肺癌细胞系NCI-H520细胞以构建hMSH2分子过表达的NCI-H520细胞模型;Western blot检测细胞中hMSH2分子表达,流式细胞计量术检测细胞膜上hMSH2分子表达,体外扩增人外周血单个核细胞中的γδ T细胞,乳酸脱氢酶释放法检测γδ T细胞对过表达hMSH2的NCI-H520细胞的杀伤效率.结果 获得hMSH2编码序列(2 805 bp),构建Fugw-hMSH2重组载体,酶切鉴定结果与预期目的条带大小相符;hMSH2-EGFP融合蛋白在NCI-H520细胞中得到表达,过表达hMSH2的NCI-H520细胞表面的hMSH2分子水平显著升高(P＜0.001);yδ T细胞对过表达hMSH2的NCI-H520细胞的杀伤效率较野生型NCI-H520细胞显著升高(P＜0.05).结论 成功构建hMSH2分子过表达的肺癌细胞模型;细胞膜上表达水平上调的hMSH2分子增强了γδ T细胞对肺癌细胞的细胞毒作用.
关键词： 人MutS同源蛋白2 γδ T细胞 NCI-H520细胞 -
左卡尼汀对多西他赛在NCI-H520细胞中抗肿瘤作用影响的研究
目的:探究左卡尼汀对多西他赛抑制肺癌细胞NCI-H520增殖的影响,并初步探索其机制.方法:实验将NCI-H520细胞分为阴性对照组,左卡尼汀组,多西他赛组以及联合用药组.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,蛋白质免疫印迹法检测目标蛋白P21,P53,BAX和BCL-2的表达情况.结果:与不同单药组(左卡尼汀组和多西他赛组)相比,联合用药组对细胞增殖的抑制作用均增强,细胞增殖率分别由(95.5±3.97)％和(65.73±2.22)％下降到(54.4±1.67)％,P＜0.01,镜下细胞密度下降.联合用药使G1/G0期细胞分别由(67.21±6.0)％和(11.52±0.89)％下降到(3.98±0.42)％,P＜0.05.G2/M期细胞分别由(11.84±5.05)％和(54.91±2.38)％上升到(64.56±0.9)％,P＜0.05.周期相关蛋白P21,P53的表达量增加,且差异均具有统计学意义.所有实验组之间的细胞凋亡率和凋亡相关蛋白BAX,BCL-2的表达量没有明显差异.结论:24 h时,联合用药组中,左卡尼汀可能通过上调P21,P53的蛋白表达来增强细胞的G2/M期阻滞,进而增强多西他赛对NCI-H520细胞增殖的抑制作用.
关键词： NCI-H520细胞 左卡尼汀 多西他赛 p21 P53 -
重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立
目的 构建pcDNA3.1(+)/GSTP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI-H520中,建立稳定转染的NCI-H520细胞系,为后续研究奠定基础.方法 以pDNR-LIB-GSTP1为模板,用PCR扩增GSTP1 cDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI-H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Western blotting检测转染前后该细胞株GSTP1基因在蛋白水平的表达.结果 pcDNA3.1(+)/GSTP1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功；经Western blotting检测,重组质粒转染株中GSTP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实GSTP1基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达.结论 成功构建了pcDNA3.1 (+)/GSTP1真核表达质粒,建立了稳定表达GSTP1的NCI-H520细胞系,为进一步研究GSTP1的生物学功能奠定了基础.
