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  • 精液白细胞与不育症之间关系探讨

    作者:CAO Xing-wu;王传航;ZHOU Qiang;李兰群;YAO Huai-guo;张圣强

    目的 以瑞-姬染色方法,油镜精细观察,区分精液中生精细胞与白细胞,探讨精液白细胞的检出率与不育症之间关系,以提供临床参考. 方法 293例精液采用瑞-姬染色,油镜进行白细胞及其他细胞形态分类,并进行统计处理.结果 293例不育症精液中检出白细胞阳性136例占46.4%;阴性157例占53.6%.年度精液白细胞阳性率1990年为13.8%;1993年为21.5%;1997年为34.1%;2006年为46.4%,说明有逐渐增加趋势.对2006年136例精液白细胞数量分布统计,以≤5个者多占70.6%;6~20个占8.9%;21~40个占3.4%;>40个占1.3%.1~4个组与5~9个组、>20个组比较,有显著差异(P<0.001).56例精液与前列腺液进行白细胞对照观察,两者均有白细胞者为48.2%(27/56).精液中非生精细胞检出率,以前列腺上皮细胞高为27.3%;其次是吞噬细胞为23.5%;再次是淋巴细胞为10.8%;支持细胞和间质细胞均为8.1%. 结论 精液白细胞有逐年增加趋势,影响精液质量造成不育症,实验室应认真检测,以油镜观察≤5个者,可考虑来源于精液;>5个者应检查前列腺,临床应注意其来源,对症治疗.

  • Y染色体性别决定区(Sry):性别决定关键开关

    作者:裴开颜;王介东

    性发育异常在人类遗传性疾病中很常见,因此性别决定在临床和生物学研究中非常重要.Y染色体性别决定区(sex-determining region of Y-chromosome,Sry)即哺乳动物Y染色体上的睾丸决定基因片段,与性别决定密切相关.本文对Sry基因的结构功能和表达调节及其相关的性别决定分子机制进行了综述.

  • 精子发生的调节机制及其进展

    作者:朱倩;崔毓桂

    精子发生是一个复杂的过程,受多种因素的精细调节以确保把正确的基因和表观遗传信息传给子代,包括激素(如FSH、LH、T和E2等)、局部调节因子(如FGF9、SHP-2以及VEGF等)以及miRNAs的调节。本文将从精子发生的激素调节、睾丸内的调节因子、miRNAs与精子发生关系等方面的研究进展进行综述。

  • 睾丸支持细胞的基本生物学特性

    作者:韩妲丽;王晓云;邢新;周广东;刘伟;曹谊林

    目的 通过了解睾丸支持细胞(Sertoli cells,SC)的基本生物学特性.探讨Sc鉴定的良好方法 . 方法 联合应用复合胶原酶及差速贴壁法从睾丸组织中分离、培养SC,光镜和电镜下观察细胞的形态、MTT法测定细胞的生长曲线,观察其在体外培养条件下的增殖特性;利用免疫细胞染色及免疫荧光染色的方法 ,检测Fas配体(FasL)的表达,观察其免疫功能;应用吖啶橙荧光染色进行细胞鉴定. 结果 联合应用复合胶原酶及差速贴壁法分离、培养的细胞在光镜下呈长柱状及三角形,增殖能力强,电镜下胞核中可见特异性卫星小体,胞质中细胞器丰富,免疫细胞染色及免疫荧光染色证实其高表达FasL,吖啶橙荧光染色可见胞核中含有大量异染色质,核仁明显,证实其为SC. 结论 复合胶原酶及差速贴壁法分离的SC具有良好的增殖能力及免疫功能,电镜、吖啶橙荧光染色是鉴定SC方便、有效的方法 .

  • 睾丸细胞生物学研究进展

    作者:祝辉;崔毓桂;周作民

    睾丸是男性生殖腺,由生精小管和间质构成.生精小管主要由生精细胞和支持细胞组成,是精子发生场所;间质中主要是间质细胞,间质细胞合成与分泌雄激素.本文介绍睾丸3种细胞的发育分化,以及成年期睾丸细胞的结构和生物学研究进展.

  • p,p’-DDE对原代培养的支持细胞周期的影响

    作者:王翀;宋明芬;张宏伟;杨克敌

    目的探讨p,p’-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)细胞周期及凋亡的影响.方法 实验采用了从大鼠睾丸组织中分离的支持细胞进行离体原代培养,染毒剂量分别为10、30和50 μmol/L,通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况.结果 在凋亡百分比中高剂量组(50μmol/L)与溶剂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),30和50 μmol/L与溶剂对照组比较在G1、S、G2/M期都有显著的变化(P<0.05).结论 浓度为50 μmol/L的p,p’-DDE对支持细胞周期有影响,可能引起细胞凋亡.p,p’-DDE可能诱导支持细胞凋亡,影响细胞周期,终可能影响生殖功能.

  • 苯并咪唑对体外培养大鼠睾丸支持细胞影响研究

    作者:于功昌;谢琳;郭启明;赛林霖;李莉;薄存香;王筱芬

    目的 研究苯并咪唑对体外培养大鼠睾丸支持细胞波形蛋白和微管蛋白表达的影响.方法 取18~20日龄Wistar雄性大鼠睾丸支持细胞,通过Tris-Hcl低渗处理进行细胞纯化,用MTT法检测阴性对照组、溶剂对照组、苯并咪唑剂量组(0.1、1、10和100 μg/ml)中大鼠睾丸支持细胞的生长抑制率.用免疫细胞化学法检测细胞中波形蛋白、α/β-微管蛋白的表达.结果 10和100 μg/ml苯并咪唑剂量组在24、48和72 h时均明显抑制了支持细胞的增殖;10和100μg/ml苯并咪唑剂量组中支持细胞波形蛋白、α/β-微管蛋白表达明显减少.结论 苯并咪唑对体外培养大鼠支持细胞毒作用明显,抑制睾丸支持细胞的增殖,影响波形蛋白、d/β-微管蛋白的表达.

  • 环磷酰胺处理致小鼠睾丸支持细胞去分化抑制精子发生

    作者:王庆忠;王汉海;刘慧莲;王东方;冯道俊;刘世武

    目的 研究环磷酰胺对小鼠支持细胞的影响.方法 睾丸组织切片的苏木素-伊红(HE)染色观察环磷酰胺对睾丸支持细胞的影响,通过免疫组织化学和细胞化学分析检测支持细胞中CK-18等的表达,通过Western-blot法检测ERK1/2的表达.结果 环磷酰胺处理导致小鼠支持细胞凋亡和数量减少,残存的支持细胞去分化,去分化的支持细胞中的ERK1/2-MAPK信号通路被激活.结论 环磷酰胺处理活化了ERK1/2-MAPK信号通路并诱导支持细胞去分化.

  • p,p'-DDE对大鼠睾丸支持细胞抑制素B表达的影响

    作者:王翀;刘宏凯;张宏伟;杨克敌

    目的 研究p,p'-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞细胞内抑制素B的影响.方法 从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养,在细胞毒性试验的基础上确定受试物的剂量,以RT-PCR方法定量抑制素B在不同剂量受试物作用下的变化情况.结果 p,p'-DDE中、高浓度组与溶剂对照组和低浓度组比较差异均有显著性(P<0.05).抑制素B的灰度值随着p',p'-DDE浓度的增高逐渐降低,呈剂量依赖关系.结论 p',p'-DDE对大鼠睾丸支持细胞分泌抑制素B表达可能存在着抑制作用.

  • p,p'-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响

    作者:宋杨;杨克敌

    目的研究p,p'-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响.方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养3天,加入不同浓度p,p'-DDE继续培养24h,应用单细胞凝胶电泳(SCGE)和反转录聚合链式反应(RT-PCR)研究p,p'-DDE诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达.结果发现支持细胞DNA迁移度随着p,p'-DDE剂量的增高而增高,同时FasL的基因表达水平也随之增高.结论p,p'-DDE可诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达,pp'-DDE可能是通过Fas/FasL途径诱导支持细胞损伤,破坏生精过程的动态平衡,终导致精子减少.

  • 阿特拉津对大鼠支持细胞凋亡的影响

    作者:宋阳;张誉;马梦婷;张立实

    目的 探讨阿特拉津对雄性SD大鼠睾丸支持细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 选用18 ~21日龄雄性SD大鼠,建立支持细胞原代培养模型.设溶剂对照组和阿特拉津10、50、100和200 μmol/L 4个染毒剂量组,对支持细胞染毒24 h后,采用MTT法检测细胞活性,免疫荧光法观察波形蛋白的表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,Real time-PCR与ELISA分别检测FasL、caspase-3与caspase-8的mRNA表达及蛋白含量.结果 阿特拉津50、100和200 μmol/L染毒组细胞活力分别为82.47%、75.23%和53.76%,与溶剂对照组比较分别降低17.53% (P <0.05)、24.77% (P <0.05)、46.24% (P <0.01).波形蛋白表达受抑制.阿特拉津50、100和200 μmol/L染毒组细胞凋亡率分别为8.53%、13.07%和14.45%,与溶剂对照组比较分别升高86.86% (P <0.01)、186.13% (P <0.01)、216.06% (P <0.01).FasL、caspase-3、caspase-8的mRNA表达及蛋白含量上调(P<0.05或P<0.01).结论 阿特拉津可影响大鼠支持细胞活性,可通过FasL途径诱导支持细胞凋亡.

  • 以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究

    作者:江芳;唐立新;马春杰;文任乾;邓顺美;汤乐;范双喜

    目的:研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据.方法:取7~8d的SD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞.以二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞.结果:用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性.结论:冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型.

  • 化学合成小干扰RNA体外转染大鼠支持细胞的实验研究

    作者:万虹;熊承良;覃颖

    目的:观察化学合成siRNA阻断大鼠支持细胞内源性基因表达的可行性,并优化转染条件.方法:体外取SD大鼠睾丸,分离、培养支持细胞,应用化学合成的不同浓度siRNA在阳离子脂质体Lipofectamice TM 2000介导下转染原代支持细胞.RT-PCR检测大鼠支持细胞中GAPDH mRNA水平的变化,MTT法检测支持细胞的活性.结果:转染终浓度为150nmol/L的siRNA能特异性有效的阻断GAPDH基因的表达,细胞毒性随浓度提高而增强,终浓度为200nmoL/L的siRNA对细胞有明显毒性.结论:siRNA能在大鼠支持细胞内启动RNA干扰,150nmol/L的siRNA能特异有效地阻断内源基因表达并保持较高的细胞活性.

  • 吡哆素L-2-吡咯烷酮-5-羧酸酯生殖毒性机制研究

    作者:陈江;章荣华;方跃强;黄李春;陈玉满;陈卫平;朱心强

    目的 研究吡哆素L-2-吡咯烷酮-5-羧酸酯(MTDX)及其组成物之一VitB6对原代培养睾丸支持细胞分泌乳酸和体外对睾丸合成睾酮的影响,探讨MTDX可能生殖毒性作用机制.方法 胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶两步分离法分离雄性SD大鼠睾丸支持细胞进行体外培养,分别加入不同浓度的MTDX(0.17 g/L,1.7g/L,17.0 g/L和34.0g/L)、不同浓度VitB6(0.1 g/L,1.0 g/L,10.0 g/L和20.0 g/L),24 h后收集培养液测定乳酸含量.利用离体组织培养和放射免疫技术,观察不同浓度的MTDX是否对大鼠睾丸睾酮的分泌有直接作用.结果 与对照组相比,MTDX 17.0 g/L和34.0 g/L剂量组乳酸含量减少;与对照组相比,VitB6 10.0g/L和20.0g/L剂量组乳酸含量减少.MTDX各剂量组和VitB6各剂量组睾丸培养液中睾酮的含量与对照组相比差异均无统计学意义.结论 MTDX可能通过减少了睾丸支持细胞乳酸的分泌而影响生殖细胞的功能,进而影响正常生殖;MTDX对睾丸分泌睾酮没有直接的抑制作用,可能对睾丸间质细胞正常功能没有影响;MTDX的生殖损害可能由其聚合物(组成物)之一VitB6引起.

  • 壬基酚对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡影响的研究

    作者:韩晓冬;汪旭莹;沈苏南;侯亚义;陈建秀

    目的探讨壬基酚对大鼠睾丸支持细胞的影响及其作用机制.方法建立体外培养大鼠睾丸支持细胞以及混合培养支持细胞和生精细胞体系,以不同浓度的壬基酚(分别为0.2μg/L、1.0 μg/L、3.0 μg/L、5.0 μg/L)作用于支持细胞和混合培养的支持细胞和生精细胞,采用MTT法测定支持细胞的活性,流式细胞仪测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法测定混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量的变化.结果随着壬基酚作用剂量的增大和作用时间的延长支持细胞的活性下降,且支持细胞的凋亡率随着壬基酚浓度的增大而提高;混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量均明显提高.结论壬基酚可引起支持细胞凋亡,进而通过Fas/FasL系统启动生精细胞凋亡.

  • 枸杞、黄芪对大鼠睾丸支持细胞抑制素合成的影响

    作者:赵龙坡;徐铮;张文;孙辉臣;汤菲

    目的:探讨中药枸杞、黄芪对大鼠睾丸支持细胞功能的作用及机制.方法:对18~22 d的大鼠睾丸支持细胞进行分离培养,用MTT法检测枸杞、黄芪对支持细胞增殖的影响,用免疫组化方法检测枸杞、黄芪对正常状态和过氧化物(H2O2)损伤状态下支持细胞抑制素βB亚基(INHβB)合成的影响.结果:枸杞、黄芪及杞芪合剂对支持细胞的增殖有促进作用;在正常培养状态下,枸杞、黄芪及杞芪合剂对支持细胞INHβB合成具有促进作用;在过氧化物(H2O2)损伤状态下,枸杞、黄芪及杞芪合剂对支持细胞INHβB合成具有保护作用.结论:枸杞、黄芪及杞芪合剂对体外培养的支持细胞抑制素βB亚基合成具有促进和保护作用.

  • 铁过载损伤小鼠睾丸支持细胞

    作者:李莉;赵昱;龚淼;王慧娟;高福禄

    目的 探讨铁过载对体外原代培养的小鼠睾丸支持细胞(SC)的影响.方法 取原代分离培养小鼠睾丸SC纯化并鉴定,加入不同浓度(50、100、200 μmol/L)右旋糖酐铁注射液,培养至24、48和72 h后收集细胞,光学显微镜与流式细胞术鉴定铁过载,流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)水平,试剂盒检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,Western blot与免疫细胞化学检测闭锁蛋白(occludin)、雄激素结合蛋白(ABP)、转铁蛋白(TRF)、抑制素(INH)和波形蛋白(VIM)的表达.结果 与对照组相比,铁过载组细胞内ROS、MDA、NO与NOS的含量显著增高(P<0.01),GSH含量、SOD和GSH-Px的活性显著降低(P<0.01),occludin、ABP、TRF、INH和VIM蛋白的表达明显降低(P<0.05).结论 铁过载可导致体外培养的睾丸支持细胞氧化性损伤并降低其功能.

  • 大鼠FasL+Sertoli细胞的分离与鉴定

    作者:段秀庆;宋纯;许评;宋春芳

    为了将睾丸Sertoli细胞应用于细胞治疗,应用胶原酶、胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶消化制备睾丸Sertoli细胞,并对其做生活观察、透射电镜检查,了解其功能状态.SABC法标记Fas配体和卵泡刺激素受体的表达情况,对睾丸Sertoli细胞加以鉴定.培养的睾丸Sertoli细胞,形态完整,细胞器和细胞核保持良好,有丰富的线粒体、内质网、高尔基复合体和溶酶体,功能状态良好.且高度表达Fas配体和卵泡刺激素受体,出现优势生长现象.Fas配体阳性的睾丸Sertoli细胞可以作为联合移植的供体,发挥其免疫赦免作用.

  • 细胞内Retinoid结合蛋白mRNA水平在生精过程中的周期性变化

    作者:陈咏梅;叶世隽;黄玉苓;郑文利

    目的研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系. 方法分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交,应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量. 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达.CRBP-Ⅰ mRNAⅦ~ⅪⅤ期处于高水平,ⅪⅠ~ⅪⅤ期达到高峰,至Ⅰ期骤然下降,Ⅰ~Ⅵ期为低水平,其中Ⅱ~Ⅳ期低,仅为高峰时期的28%.CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ~Ⅵ期为低水平,Ⅶ~ⅪⅤ期水平增加1倍以上,其中Ⅶ~Ⅷ期达到高峰,随后缓慢下降. 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ,且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化.总的来说Ⅶ~ⅪⅤ期合成量较高,生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用.CRBP-ⅠⅪⅠ~ⅪⅤ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用.总之,SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素.

  • 新生昆明小鼠睾丸支持细胞和精原细胞的共培养及支持细胞的作用

    作者:张晓丽;高英茂;赵舒武;邴鲁军

    目的 分离、纯化、培养小鼠睾丸支持细胞,通过与精原细胞共培养,研究体外培养的支持细胞对精原细胞的影响.方法 用复合酶消化、密度梯度离心和差异贴壁法分离、纯化、培养新生小鼠睾丸支持细胞,以苏丹Ⅳ染色鉴定支持细胞;用丝裂霉素-C处理支持细胞后作为饲养层,与精原细胞共培养;以直接分离培养的精原细胞作对照.倒置相差显微镜观察,细胞培养第3天,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定精原细胞的增殖率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/磷脂酰肌醇(ANNEXIN-V-FITC/PI)染色;激光扫描共焦显微镜观察记录精原细胞的凋亡率,比较精原细胞克隆大小、存活时间、增殖率和凋亡率的不同. 结果 分离、纯化后经苏丹Ⅳ染色鉴定的小鼠支持细胞纯度可达95%以上,与支持细胞共培养的精原细胞的克隆大小、存活时间和细胞增殖率明显高于对照组,而凋亡鲻率则明显低于对照组.结论支持细胞可以促进精原细胞的增殖,抑制其凋亡.

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