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靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选
目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.
关键词： 髓样细胞表达的激发受体1 短发夹RNA 质粒 RNA干扰 基因表达 -
α黑素细胞刺激素在TREM-1介导的树突状细胞成熟中的调节作用
研究α黑素细胞刺激素(α-MSH)对髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)介导树突状细胞(DC)成熟的调节作用.用TREM 1激动性抗体处理单核细胞,诱导其分化成MoDC,在此过程中加入α-MSH.观察MoDC的细胞形态,以FACS进行表型测定,用混合淋巴细胞反应检测MoDC的抗原提呈功能,并观察α-MSH对MoDC表达TREM-1的影响.结果显示,α-MSH和TREM-1激动性抗体作用MoDC后,多数细胞突起少且钝,α-MSH对TREM-1激动性抗体处理的MoDC高表达MHC Ⅱ、CD86及CD1a有抑制作用,并降低MoDC刺激同种异体T细胞增殖的能力.α- MSH可下调LPS诱导MoDC表达TREM-1的水平.上述结果表明,α-MSH能抑制TREM-1介导的MoDC成熟.
关键词： α黑素细胞刺激素 树突状细胞 髓样细胞表达的激发受体1
