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检测甲型流感病毒的绿色荧光蛋白报告系统的构建与鉴定
目的 构建pDZ-EGFP的真核表达重组质粒,转染MDCK细胞,建立增强型绿色荧光蛋白稳定转染的报告细胞系,提供更为直观、快速的检测甲型流感病毒的新途径.方法 将PCR扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入到pDZ载体中,将获得的pDZ-EGFP重组质粒用lipo-fectamine 2000转染MDCK细胞,通过G418进行选择培养,建立稳定转染的细胞系.传至3代,提取细胞总DNA,用EGFP的特异性引物进行PCR扩增及测序,鉴定细胞报告系统的稳定性；接种标准甲型流感毒株,用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法检测EGFP的表达情况验证其应用性；另外,接种临床样本100份,用EGFP细胞报告系统检测的结果与Real-time RT-PCR检测结果进行比较,鉴定细胞报告系统的特异度和灵敏度.结果 稳定细胞系经传至3代,特异性EGFP引物利用PCR扩增到816bp的目的条带,测序结果与扩增的EGFP基因序列100％符合；稳定细胞系接种标准甲型流感毒株,24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的增强表达,72h后用细胞裂解产物与EGFP的特异性抗体反应,获得目的条带；EGFP细胞报告系统检测的100份临床样本与Real-time RT-PCR检测结果相比,其特异度和灵敏度分别为88.52％和89.74％.结论 成功构建了pDZ-EGFP真核表达载体及稳定转染的MDCK细胞系,为甲型流感病毒的细胞培养鉴定及后期的致病机制的研究奠定了基础.
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外源EGFP表达对肿瘤细胞体外生物学行为的影响
目的 探讨常用的可视化细胞标记技术-外源EGFP表达对肿瘤细胞生物学行为的影响.方法 选择不同的携带EGFP的载体,利用脂质体转染或慢病毒感染技术,在不同肿瘤细胞系中表达外源EGFP,筛选稳定表达外源EGFP的细胞系,MTT法检测细胞体外增殖能力；细胞分析计数仪(CasyTT型)检测细胞大小；Transwell体外迁移实验检测细胞体外侵袭能力.结果 成功建立了稳定表达外源EGFP的人结肠癌细胞系HCT116-GFP、HCT116-EGFP、COLO320DM-EGFP和小鼠树突状细胞肉瘤细胞系DG6-EGFP.HCT116-EGFP细胞、COLO320DM-EGFP细胞和DG6-EGFP细胞的体外增殖能力明显降低；HCT116-EGFP细胞体积增大:平均直径分别为(14.53±0.07) μm( HCT116)和(18.28±0.16) μm (HCT116-EGFP) (P＜0.01)；HCT116-EGFP细胞的体外侵袭能力明显降低(P＜0.01).结论 外源EGFP可视化标记细胞后,可能会影响肿瘤细胞的生物特性,利用这些模型进行科研时,需注意对相关指标的影响.
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EGFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用
本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1因调控功能中应用的可行性.利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP-1载体中,转化感受态E. coli茵细胞,筛选了阳性转化茵落,通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落,抽提重组质粒DNA;同时将重组质粒转染K562细胞,通过荧光显微镜检测重组质粒的功能.结果表明:通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体(pEWP)和含有WT1基因启动子和增强子的载体(pEWPE、pEWPA和pEWPD).转染48小时后,pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光,而转染了空载体pEGFP-1的K562细胞未出现荧光.结论:EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究,为进一步开展基因治疗创造了条件.
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KGF和EGFP双基因共表达的重组腺病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究
为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度.转染至小鼠骨髓MSC中,为胸腺组织修复免疫功能恢复提供前期实验基础.结果表明:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-mKGF重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.6kh和5.1 kb 2个条带；重组腺病毒载体质粒pAdxsi-mKGF病毒质拉经酶切鉴定得到阳性克隆；测定重组腺病毒Ad-EGFP-mKGF半数组织培养感染量的滴度为1.6×1010 pfu/ml.转染后10 hMSC开始表达荧光,6-8 d达高峰,转染率可达92.3％,28d仍有表达.结论:pAdxsi-mKGF病毒质粒构建成功并能高效、安全地转染MSC.
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腹侧听泡外入路小鼠耳蜗鼓阶基因导入的实验研究
目的 研究腺病毒携带目的 基因经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的可行性及目的 基因的表达特点.为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据.方法 16只健康5周龄C57BU6J小鼠,腺病毒组10只,以重组腺病毒携带有Hath-1和增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluoreseent protein,EGFP),人工外淋巴液组6只以人工外淋巴液,经腹侧听泡外入路导入耳蜗鼓阶底转.分别于术后第7天分别行听性脑干反应(ABR)检查后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片、耳蜗冰冻切片观察基因的表达.结果经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法 对听力影响较小.腺病毒组耳蜗内目的 基因呈广泛表达.对照组耳蜗未见荧光表达.结论 经腹侧听泡外人路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法 对听力影响较小,且能够将目的 基因成功转导至耳蜗组织并广泛表达.
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甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位
目的 利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,M)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础.方法 为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化.毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞.结果 毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致.该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生.结论 毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞.
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含dMAR真核表达载体的构建及影响EGFP表达的研究
目的研究dMAR对EGFP基因表达的调控作用.方法用Kpn I酶切pGFP/MAR,回收含MAR下游850bp的片段dMAR,与Kpn I酶切回收的pEGFP-C1载体连接,Hind Ⅲ酶切鉴定方向,构建正向、反向连接的真核表达载体pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR.将该表达载体转染COS7细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达并采用流式细胞术进行荧光定量.结果 pEGFP-C1,pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR转染后48 h EGFP的表达量分别为45.1%、40.5%和11.3%.结论 pEGFP/dMAR显著抑制了EGFP的表达,pEGFP/dMAR′的增强表达作用不明显.
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慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞的研究
1998年Thomson等[1]成功分离、建立了人胚胎干细胞(hESC)细胞系之后,有关hESC的研究得到迅猛发展.hESC的自我更新和分化过程涉及到多种相关基因表达的活化或抑制,而开展这方面的研究需要有效的转基因技术来完成.由于hESC的培养条件非常苛刻,外源基凶的转入通常较困难.常用的转基因方法如脂质体、电穿孔、磷酸钙共沉淀等不能有效地将外源基因转入hESC中.目前关于hESC的转基因研究报道较少,我们采用慢病毒(lentivirus)载体成功地将绿色荧光蛋白(EGFP)基凶转入hESC,建立了稳定表达EGFP的hESC细胞系.
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超声击破微泡介导EGFP转染类风湿性关节炎大鼠关节滑膜组织的实验研究
关节疾病的基因治疗是当今国内外研究的热门课题[1].超声击破微泡造影剂介导作为一种新型的基因转染方法,在心脏、脑、角膜及肿瘤组织中得到实验证实[2-4].本实验旨在探讨该方法在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis:RA)滑膜组织中实现基因转染的可能性.资料与方法一、质粒的提取与鉴定取大肠杆菌DH5α制备感受态细菌,将质粒pEGFP-C1转化感受态细菌,挑取单菌落接种到LB培养基中,37℃振荡培养过夜.提取质粒后酶切电泳鉴定.二、实验动物及分组1.建立RA大鼠动物模型:24只正常清洁级Wister大鼠,雌雄各半,体质量258～279 g,平均(261.57±5.42)g.Ⅱ型胶原乙酸溶液(4 mg/ml)4℃搅拌过夜后按1∶1滴加至冷的福氏完全佐剂中,充分乳化.每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3点皮内注射乳化液共0.25 ml,7d后用同样方法加强注射一次.大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2mm为造模成功.
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EGFP 标记的 H460细胞株建立
目的：建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的 H460细胞株，优化建系方法。方法质粒转染建立表达 EGFP 的 H460细胞株，稀释法挑选表达 EGFP 的阳性单克隆，荧光显微镜观察绿色荧光，Western blot 检测EGFP 表达，流式细胞仪分选 EGFP 表达阳性的细胞。结果成功建立稳定表达 EGFP 的 H460细胞株，其 EGFP 阳性表达率高。结论建立稳定表达 EGFP 的 H460细胞株，为以后建细胞系提供更简便有效的方法，H460-EGFP 可以作为研究工具用于后续观察抗癌新药体内的抗癌作用。
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使用荧光检测法替代MTT检测法进行抗癌药物筛选的可行性
我们提出一种新型的基于体外细胞株增殖抑制的药物筛选方法,该方法 使用了绿色荧光蛋白(GFP),既简单又省时可靠.我们的实验数据显示,使用绿色荧光蛋白的结果 比MTT测定法更加一致可靠.我们的数据还证实了新的检测方法 在细胞生长曲线的灵敏度和精度、抗癌药物的抑制作用、剂量反应.
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新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用
背景:构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道.目的:观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达.方法:通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞.通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选5 d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析.结果与结论:经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群.
关键词： 多位点Gateway技术 慢病毒 人骨髓间充质干细胞 PEDF EGFP -
重组MAGE-A1/EGFP质粒转染人树突状细胞体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫
目的:应用人重组真核表达载体pMAGE-A1/EGFP转染的树突状细胞(DCs)在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫.方法:构建重组质粒pMAGE-A1/EGFP,体外电转染该质粒入DCs,通过流式细胞仪检测和胞内染色法LDH法比较转染前后DCs在蛋白表达、细胞成熟度和诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫能力的差异.结果:成功构建pMAGE-A1/EGFP真核表达质粒,电穿孔法导入DCs后观察到MAGE-A1与EPFG实现等效表达,分别为8.8%±0.9%和8.47%±0.78%.pMAGE-A1/EGFP转染的DCs表面CD86、CD40L和CD83表达水平显著升高,提示DCs的成熟度增加;同时表达的MAGE-A1蛋白可与小鼠来源抗MAGE-A1的单抗发生特异性结合,并在体外诱导MAGE-A1特异性CD4+T细胞克隆扩增,当再次接触MAGE-A1抗原时大量分泌IFN-γ.结论:pMAGE-A1/EGFP转染的DCs不仅能在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫,还可通过流式细胞仪进行快速检测,为临床开展MAGE-A1为基础的免疫治疗奠定了一定基础.
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一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立
目的:建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统.方法:通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件:大肠杆菌生物素连接酶(BirA)、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白(SA-TetR)和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白(Avitag-VP16).将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况.结果:随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍.结论:可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统.
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pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒的构建及在MCF-7乳腺癌细胞中的转染
目的 构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒,并进行鉴定.为进一步研究Smad3在抑制乳腺癌生长机制中起到的作用提供实验基础.方法 利用RT-PCR方法从MCF-7乳腺癌细胞中获得cDNA,应用PCR方法扩增、提取 Smad3的基因片段,酶切后与pEGFP-C3真核表达载体连接,构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功.将构建的质粒瞬时转染至MCF-7乳腺癌细胞中,通过荧光倒置显微镜观察、RT-PCR技术及Westen blot技术鉴定转染是否成功.结果本实验成功构建了pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒.结论 pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒瞬时转染到MCF-7细胞中,可使Smad3在基因与蛋白水平的表达显著上调.
关键词： EGFP smad3 真核表达载体 MCF-7乳腺癌细胞 -
Endostatin、FHIT和EGFP串联表达载体的构建
本研究将内皮抑素基因插入到包含人脆性组氨酸三联体基因的pIRES2-EGFP-FHIT中构建真核多基因表达载体pEF1-FHIT-EGFP-ES,脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.RT-PCR、RT-PCR southern blot分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察结果显示EGFP在Hela细胞中得到表达.本研究为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.
关键词： 多基因 IRES endostatin FHIT EGFP -
BALB/c小鼠口服诱导EGFP融合标签免疫耐受的观察
目的 在BALB/c小鼠中通过口服EGFP融合标签蛋白建立免疫耐受,比较不同灌饲年龄对于免疫耐受诱导的影响,提高融合蛋白抗原单抗制备效率.方法 不同年龄BALB/c小鼠口腔灌饲EGFP蛋白,再经过三次注射抗原刺激后,采用酶联免疫方法检测小鼠针对EGFP蛋白的血清抗体滴度,比较口服诱导BALB/c小鼠免疫耐受效果.结果 新生期灌饲的小鼠经过注射抗原刺激后几乎不产生针对EGFP抗原的抗体,成年期灌饲小鼠经过注射抗原刺激后产生针对EGFP抗原的抗体,血清抗体滴度与未经灌饲小鼠接近.离乳期灌饲对于免疫耐受诱导没有显著影响.结论 新生期灌饲抗原可以有效诱导BALB/c小鼠对EGFP的免疫耐受,而成年期灌饲没有诱导效果.
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人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达
目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.
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一种活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基过表达慢病毒载体的构建及功能初步测定
目的:构建含活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基(去除氨基酸702～712的mTERT,命名为mTERT△)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能.方法:从先前构建的表达mTERT全长的pDC315-EGFP-mTERT质粒中,通过缺失突变PCR扩增小鼠mTERT△基因,构建真核表达载体GV287-EGFP/mTERT△.鉴定正确后将目的基因克隆人慢病毒载体pGC-LV,得重组载体pGC-LV/mTERT△-EGFP,采用Lipofectamine2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒LV-mTERT△-EGFP后感染神经干细胞和原代神经元,TRAP-PCR方法检测端粒酶活性,荧光显微镜观察目的片段表达和细胞增殖情况.结果:成功构建TERT△基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-LV/mTERT△-EGFP构建成功.包装慢病毒颗粒LV-mTERT△-EGFP可以感染神经干细胞和神经元,端粒酶活性测试证明目的蛋白的端粒酶催化活性缺陷,抑制神经干细胞增殖,抑制内源性mTERT功能.结论:慢病毒载体LV-mTERT-EGFP构建成功,可以表达无活性mTERT片段.
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EGFP-CIDE-3及DsRed 1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位
目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.
