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WT1高表达、CD34+和Auer+与急性髓细胞性白血病患者预后的关系
目的:探讨急性非M3髓细胞性白血病(AML non-M3)患者骨髓WT1表达水平的临床意义,了解CD34+和Auer+的AML的生物学特征及其对初次诱导缓解率和预后的影响.方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测92例初诊AML(non-M3)患者骨髓WT1表达水平,分析初次诱导缓解率(CR1)与总生存率(OS)的关系.比较CD34+和CD34-以及Auer+和Auer-AML患者在CR1和OS方面的区别.结果:初诊时WT1高表达的AML具有较低的CR1 (P ＜0.05).CD34+患者的CR1较CD34-者低(P＜0.05),Auer+的AML患者CR1较Auer-AML患者高(P＜0.05).WT1高表达组的OS低于低表达组,具有显著性差异(P＜0.05).CD34+组的OS低于CD34-组,且具有显著差异(P＜0.05),Auer+组与Auer-组的OS没有明显差异.结论:AML患者骨髓WT1高表达及CD34+提示患者的预后不良,Auer小体阳性仅与CR1相关,而与OS无关.
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急性髓系白血病中HtrA2和WT1基因的表达
本研究通过检测HtrA2和WT1基因在急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞及细胞系中的表达,探讨其表达水平与临床变量的关系及二者之间的相关性.应用RQ-PCR方法检测104例初诊AML患者的HtrA2和WT1基因表达水平；比较其表达量与正常对照的差别,并分析与年龄、性别、白细胞计数、诊断分型、预后分型及治疗疗效的关系；比较治疗前后表达量的变化,分析HtrA2与WT1二者相关性.结果表明:AML患者骨髓细胞中HtrA2表达量显著低于正常对照组(P＜0.01),而WT1则显著高于正常对照组(P＜0.01)；二者表达量与患者年龄、性别、白细胞计数无关；HtrA2在不同的NCCN预后分组中表达量无显著差异,而WT1在预后良好组表达量明显低于预后中等组(P=0.003)；无论完全缓解(CR)组还是非完全缓解(non-CR)组HtrA2表达量在治疗后均显著高于治疗前(P＜0.05),而WT1表达量只有在CR组治疗后才低于治疗前(P＜0.01),non-CR组治疗后虽然也低于治疗前,但差异无统计学意义；HtrA2与WT1的表达水平呈弱负相关(r=-0.249,P=0.011).结论:HtrA2和WT1表达与白血病的发生、发展密切相关,二者表达水平呈负相关,上调HtrA2基因的表达和干扰WT1基因的表达有望成为白血病治疗的靶点.
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Wilms瘤基因WT1表达与急性白血病微小残留病的检测
近年来发现急性髓性白血病(AML)有Wilms瘤抑制基因WT1的异常表达,且表达水平与预后呈负相关,提示其可作为一种新的白血病标志.为探讨WT1能否作为急性白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)的标志,我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定了WT1基因的灵敏度,并与肿瘤特异性标志基因进行比较.所有样本RNA的质量均用内对照c-abl基因证实.以两轮RT-PCR扩增WT1和肿瘤特异性融合基因检测白血病细胞的极限在NB4细胞分别为10-4和10,而在K562细胞分别为10-3-10-4和高于10-6;在29例供血员的外周血单个核细胞(MNC)均未检测到WT1基因表达,但在21例非恶性疾病患者骨髓MNC中有8例呈WT1基因阳性(38.1%).本研究提示,监测WT1表达可用于AML的疗效评价及MRD随访,并与是否存在肿瘤特异性标志无关.
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白介素12降低白血病和骨髓增生异常综合征患者外周血单个核细胞WT1基因的表达
有研究证实,白细胞介素12(IL-12)可以增强自然杀伤细胞的细胞毒性,还可以促进细胞毒T细胞对原代白血病细胞及白血病细胞株的细胞毒反应.此外,Wilms癌基因WT1 mRNA作为微小残留病变的标志已被广泛用于监测急性白血病(AL)和骨髓增生异常综合征(MDS)的疗效.为了研究IL-12能否降低AL和MDS患者外周血单个核细胞WT1基因的表达,分别收集了30例恶性血液病患者和5例健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMNC)进行体外培养,在培养体系中加入IL-12.培养前和培养后第3天,用竞争性RT-PCR方法分别测定各标本中WT1mRNA的表达量.结果显示,在6例慢性粒细胞性白血病患者,WT1 mRNA由104.8降至104.2拷贝/微克总RNA;在12例MDS患者,WT1 mRNA由105.4降至104.8拷贝/微克总RNA;在5例完全缓解期AL患者,WT1 mRNA由105.0降至104.2拷贝/微克总RNA;但在7例未缓解的AL患者,WT1 mRNA的表达无变化.结论:IL-12可以显著降低大部分恶性血液病患者WT1 mRNA的表达水平,IL-12有望用于去除恶性血液病患者体内的微小残留病变.
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WT1基因在骨髓增生异常综合征及急性白血病患者中的表达
为了研究WT1基因在骨髓增生异常综合征(MDS)和急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后的关系,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测22例MDS和69例AL的WT1 mRNA的表达.结果表明,WT1 mRNA在MDS-RA及MDS-RAS中低表达,阳性率为10%(1/10);在MDS-RAEB和MDS-RAEB-t中高表达,阳性率为91.7%(11/12),两者差异有统计学意义(P＜0.01).WT1 mRNA在各型急性白血病中均有表达,初发和复发急性白血病中WT1 mRNA的阳性率(69%)高于缓解患者(12.5%)(P＜0.01).初发与复发AL的WT1mRNA的相对表达量无差异,而MDS-RAEB和RAEB-t的表达量低于初发AL患者.WT1 mRNA阳性的AML患者的化疗缓解率(41%)低于阴性患者(78%);WT1基因相对表达量≥1的AML患者的CR率(18%)低于＜1的患者(55%).结论:WT1基因在MDS-RAEB和MDS-RAEB-t中的表达明显高于MDS-RA和MDS-RAS,动态监测WT1基因的表达可能有助于监测MDS的病情变化.WT1基因表达与否及表达高低与初发AL的预后有关;WT1基因是急性髓细胞白血病的一个独立的预后因素.
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白血病U937细胞系WT1基因静默的机制研究
本研究探讨白血病细胞系WT1基因的甲基化状况及其与表达的关系.用甲基化抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂成功诱导WTI表达.用地西他滨、曲古抑菌素处理白血病U937、HL-60、K562细胞系,用RT-PCR、改良的硫化PCR结合限制性内切酶技术检测mRNA表达.结果表明,U937细胞不表达WT1基因,而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因；HL-60细胞WT1基因没有甲基化,而K562和U937细胞发生了甲基化.地西他滨、曲古抑菌素单药处理U937细胞不能诱导WT1基因表达,而二药联合作用可以诱导U937细胞系WT1基因重新表达.结论:单纯DNA甲基化不能抑制白血病细胞WT1基因表达；DNA甲基化与组蛋白脱乙酰基共同抑制了WT1基因表达；地西他滨、曲古抑菌素联合作用可以重新诱导WT1基因表达.
关键词： 白血病:U937细胞 WT1基因 基因静默 -
正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究
本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系.采用实时荧光定量RT-PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34+ CD38￣、CD34+ CD38+、CDl5+ CD11b+、CD33+CD14+、CD20+ CD5￣和CD20￣CD5+细胞群中总WT1、WT1(+17AA)及WT1(+KTS)的表达.结果表明:与K562细胞相比,CD34+ CD38￣、CD34+ CD38+、CD15+ CD11b+ 和CD33+ CD14+细胞群中均存在WT1基因的低表达,且依次逐渐降低;在CD20+ CD5￣和CD20￣CD5+细胞群中未检测到WT1基因表达.在分化程度较低的CD34+ CD38￣和CD34+ CD38+细胞群中以+17AA,+KTS及WT1(+/+)异构体为主,而较成熟的CD15+ CD11b+ 和CD33+CD14+细胞群中以-17AA、-KTS及WT1(-/-)异构体为主.结论:在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低,造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用.
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EGFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用
本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1因调控功能中应用的可行性.利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP-1载体中,转化感受态E. coli茵细胞,筛选了阳性转化茵落,通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落,抽提重组质粒DNA;同时将重组质粒转染K562细胞,通过荧光显微镜检测重组质粒的功能.结果表明:通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体(pEWP)和含有WT1基因启动子和增强子的载体(pEWPE、pEWPA和pEWPD).转染48小时后,pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光,而转染了空载体pEGFP-1的K562细胞未出现荧光.结论:EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究,为进一步开展基因治疗创造了条件.
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WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究
本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础.以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度.以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性.结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA.就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p＜0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达低,仅为0.99±0.02倍.在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p＜0.05).后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍.pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍.结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性.
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荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血 WT1基因表达及其临床意义
为研究WT1基因表达与临床疗效和预后的关系,探讨其在白血病微小残留病检测中的作用,用荧光定量RT-PCR方法检测55例初发白血病患者外周血及10例正常人外周血的WT1基因表达,跟踪20例急性白血病患者外周血WT1基因表达.结果显示,白血病初治组(40例ANLL、15例ALL)与正常人外周血WT1基因表达有显著差异(P＜0.001).在急性白血病患者中,WT1≤6.8×10-3组生存期长于WT1＞6.8×10-3组(P=0.027);白血病患者初发时WT1呈高度表达,完全缓解后,迅速或缓慢下降至少1个对数级,复发时再次增高.跟踪检测20例急性白血病患者外周血WT1基因表达,结果7例复发,5例在临床复发前2-3月WT1的水平明显增高,至少上升0.8个对数级.结论:荧光定量RT-PCR方法检测白血病外周血WT1表达具有简便易行、准确性高、特异性好的特点.与正常人外周血比较,WT1在各类白血病外周血中呈高度表达,且表达水平与预后负相关;对外周血WT1基因表达进行定量分析,可用于微小残留病的监测.
关键词： 急性白血病 微小残留病 WT1基因 荧光定量RT-PCR -
Wt1基因与Ph+白血病细胞系K562的生物学特性
Wt1基因是与造血调控、白血病发生及治疗预后密切相关的双功能基因,在急性髓系白血病及慢性粒细胞白血病进展期呈高表达,且与预后呈负相关,已用于临床微量残留病的监测.WT1蛋白不同亚细胞定位发挥不同生物学功能.本研究旨在探讨Ph+白血病细胞系K562中wt1 mRNA及蛋白的表达与定位,wt1抑制剂--姜黄素(curcumin)对K562细胞的增殖及细胞周期的影响及wt1在白血病发生发展中的相关作用机制.采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;免疫荧光技术及Western blot观察WT1蛋白的亚细胞定位及药物处理后表达水平的变化;实时定量PCR法观察药物处理后wt1及bcr/ab1 p210转录本水平的变化.结果表明,wt1 mRNA及蛋白在K562细胞高表达,姜黄素及格列卫均能降低wt1 mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞增殖;姜黄素使K562细胞停滞于G2/M期,而格列卫使其停滞于G0/G1期.结论:wt1基因表达改变可以影响Ph阳性细胞-K562的生长、增殖,调控wt1表达有可能成为Ph阳性白血病的新的治疗策略.
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WT1基因与白血病
WT1基因能抑制生长因子和生长因子受体的转录,因此被归类为肿瘤抑制基因,但在人类白血病细胞WT1基因呈高表达,其表达水平与预后呈负相关.WT1基因的反义寡核苷酸可抑制白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡;野生型的WT1转染髓系祖细胞后,可使细胞失去受粒细胞集落刺激因子的诱导分化,而代之以持续增殖.这些现象提示,在造血祖细胞WT1基因可能起癌基因的作用.
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WT1介导的转录调控通路与白血病
WT1基因编码的锌指转录因子能调控下游基因的转录,其中很多靶基因涉及调节细胞周期和增殖分化,而WT1本身也接受其上游基因的调控,如NF-κB和GATA-1等,这样便构成WT1介导的转录调控通路,参与造血系统发育的调控.如果转录因子的表达脱调控以及随之而来的正常基因表达态势受干扰,常会引起造血细胞的增殖、分化及凋亡动态平衡的紊乱,终导致白血病.本文就WT1介导的转录调控通路与白血病的关系作一综述.
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WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究
为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6+转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由+17AA/+KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.
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儿童急性髓系白血病WT1基因的实时荧光定量RT-PCR检测及其临床意义
本研究建立实时荧光定量RT-PCR方法检测儿童急性髓系白血病WT1基因(AML)mRNA的表达并探讨其临床意义.采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,检测30例初治AML患儿、12例缓解期患儿(30份)、18例复发患儿,30例细胞形态学正常人的骨髓标本中的WT1基因的表达水平,并动态检测20例初治患儿WT1基因的表达.以ABL为内参照,采用2(-△△ct)法计算其相对表达量.结果表明:①初治AML患儿WT1基因的表达高于正常对照组和缓解组(P<0.001);缓解AML患儿WT1基因的表达与正常对照组的差异无统计学意义(p>0.05);复发AML患儿WT1基因的表达与初治组的差异无统计学意义(p>0.05);②动态监测儿童AML 20例显示,初治时WT1高表达,完全缓解后WT1表达水平下降,复发时WT1表达水平明显升高.20例中5例在临床复发前3-7个月表达水平开始上升.③动态检测的20例患儿初治时WT1阳性组和阴性组完全缓解率(CR)、3年总生存率(OS)无显著差异(p>0.05),治疗后第22-30天的WT1阳性组3年OS显著低于阴性组(p<0.05).结论:SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法是一种快速有效,灵敏度高,特异性好的方法.WT1基因在儿童急性AML中表现为促癌基因的作用,WT1基因表达水平的变化有助于疗效评价,微小残留病的检测和预后判断.
关键词： WT1基因 实时荧光定量RT-PCR 急性髓系白血病 -
急性髓细胞白血病WT1基因突变的检测与临床意义
WT1基因是早发现与Wilms肿瘤发生、发展有关的基因,1990年由Call等克隆并定位于染色体11p13,全长约50 000 bp,共有10个外显子,相对分子质量为52 000～54 000,是一种锌指蛋白,也是一种双向转录调控因子,其等位基因的功能缺失在Wilms肿瘤的发生中起重要的作用[1-3].近年来发现在白血病尤其AML中WT1基因有异常的高表达,而且表达水平与预后有关,高表达可能导致较差的预后[4-5].本研究应用PCR-SSCP法对AML患者的WT1基因突变进行检测分析,以研究AML患者WT1基因突变对该疾病的发生、发展和预后评估的意义.
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真性红细胞增多症患者WT1基因甲基化状态的初步研究
真性红细胞增多症(PV)是一种克隆性干细胞疾病,以全血容量增多,血液黏稠度增高及脾肿大为主要表现.而再生障碍性贫血(AA)系多种病因引起的造血功能衰竭,以全血细胞减少为主要表现的一组综合征.两种红细胞疾病一种是红细胞增多,一种为红细胞减少,其表观遗传学是否有联系值得研究.在红细胞疾病的研究中,国外有学者报道[1],阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者WT1基因的mRNA表达增加且明显高于AA患者,并且WT1基因的mRNA表达与PNH单核细胞表面的CD16b缺失率呈正相关,推测WT1基因产物的表达增多可能与PNH的克隆扩增机制有关.
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肾脏疾病与WT1基因
肾脏疾病是导致终末肾(end-stage renal disease,ESRD)的常见原因之一.近年来的研究进展提示,在表现为蛋白尿甚至肾病综合征的肾脏疾病中,许多类型与WT1基因(Wilms′tumor 1 gene,WT1)突变有关,如孤立性激素耐药型肾病综合征(isolated steroid-resistant nephrotic syndrome,ISRNS)[1]、孤立性弥漫性系膜硬化(isolated diffuse mesangial sclerosis,IDMS)[2]、Denys-Drash综合征(Denys-Drash syndrome,DDS)[3]和Frasier综合征(Frasier syndrome,FS)[4]等.本文就WT1突变所致肾脏疾病的临床病理特点、WT1及其功能、WT1突变特点及WT1突变分析的临床意义作一简要综述.
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汉族散发性激素耐药型肾病综合征15例NPHS2和WT1基因遗传学变异
近年来的研究证实NPHS2基因(NPHS2)突变可引起散发性激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephroticsyndrome,SRNS)[1];WT1基因(WT1)突变可引起孤立性SRNS等肾脏疾病[2].我们对15例汉族散发性SRNS患儿进行了NPHS2和WT1基因检测.
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急性髓系白血病患者外周血WT1基因的表达水平及其与血清IL-6、C3、C4的关系
目的 探讨急性髓系白血病患者外周血WT1基因的表达水平及其与血清白细胞介素-6(IL-6)、补体C3和C4的关系.方法 选取48例急性髓系白血病初治患者,25例急性髓系白血病缓解患者,29例急性髓系白血病复发患者,另选取19例健康体检者作为对照,采用实时荧光定量PCR检测4组研究对象的外周血WT1基因表达水平,采用酶联免疫吸附试验检测4组研究对象的血清IL-6、C3、C4水平,分析WT1基因与IL-6,C3、C4表达水平的相关性.结果 急性髓系白血病初治组患者的WT1 mRNA、IL-6、C3、C4表达水平均高于对照组,急性髓系白血病缓解组患者的WT1 mRNA、IL-6、C3、C4表达水平均低于急性髓系白血病初治组,急性髓系白血病复发组患者的WT1 mRNA、IL-6、C3、C4表达水平均高于急性髓系白血病初治组,差异均有统计学意义(P＜0.05).急性髓系白血病初治组患者的外周血WT1 mRNA与血清IL-6、C3、C4表达水平均呈正相关(r=0.421、0.406、0.454,P＜0.05).结论 WT1 mRNA、IL-6、C3、C4在急性髓系白血病患者中呈高表达,提示WT1、IL-6、C3、C4参与急性髓系白血病的发生和发展,可为急性髓系白血病的临床诊断及靶向治疗提供一定的理论依据.
