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新型Smac模拟物Tat-Smac N7的肿瘤细胞辐射增敏作用
目的 观察Tat-Smac N7融合肽对人肺癌细胞系H460和人食管癌细胞系EC109的辐射增敏作用,探讨其辐射增敏机制.方法 取对数生长期H460和EC109细胞,分为DAPI对照组、FITC-Smac N7和FITC-Tat-Smac N7组,荧光显微镜观察两种细胞不同时间药物入核情况.取对数生长期H460和EC109细胞,分为单纯照射组、照射联合Tat-Smac N7组,单纯照射组给予0、2、4、6 Gy照射,照射联合Tat-Smac N7组中Tat-Smac N7的浓度为20 μmol/L,WST-1测定Tat-Smac N7的辐射增敏作用.取对数生长期H460和EC109细胞,分为对照组、Tat-Smac N7组、单纯照射组和照射联合Tat-Smac N7组,吸收剂量为4 Gy,Tat-Smac N7浓度为20 μmol/L,细胞流式分析仪测定细胞不同时间的细胞凋亡率.结果 Tat-Smac N7融合蛋白进入2种细胞系后2h可以有蓄积,且这种蓄积可延续到24 h,而Smac N7则不能进入细胞.Tat-Smac N7能够增强H460和EC109细胞的辐射敏感性(F=22.2、13.2,P＜0.05),照射联合Tat-Smac N7可明显增加辐射诱导的细胞凋亡率(24 h:F=9.32、5.86,P＜0.05;48 h:F =7.09、8.25,P＜0.05).Tat-Smac N7联合照射后凋亡诱导效应具有时间依赖性.结论 Tat-Smac N7融合肽可促进肿瘤细胞的辐射敏感性,作为一种新的Smac蛋白类似物,有望用于肿瘤的辐射增敏治疗.
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ABCE1基因通过RNase L途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡
目的：研究ABCE1基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞，分为A组(转染ABCE1-siRNA-1组)、B组(转染ABCE1-siRNA-2组)、C组(转染空质粒组)以及D组(空白对照组)。将构建好的ABCE1的siRNA(小干扰RNA)载体转染入培养的细胞中，荧光显微镜下观察转染效率，Western Blot法检测ABCE1蛋白以及RNase L蛋白的表达，RT-PCR法检测ABCE1 mRNA的表达，MTT法分析细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞，转染后A、B组的细胞活性降低，ABCE1的表达受到阻断(P＜0.01)，RNase L蛋白含量明显增加(P＜0.01)，细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡(P＜0.01)。结论 ABCE1基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡，其机制是阻断了2-5A/RNase L细胞通路。
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99mTc-zaptuzumab的制备
目的 死亡受体5(death receptor 5,DR5)单克隆抗体zaptuzumab可以激活DR5,特异地引起肿瘤细胞的凋亡.zaptuzumab体内结合肿瘤细胞的显像研究有助于了解DR5的分布和zaptuzumab靶向肿瘤的性能.方法 本研究采用琥珀酰-联肼尼克酰胺(Hynic,succinimidyl 6-hydrazinonicotinate)法在zaptuzumab上标记99mTc;薄层层析法分析标记效率;排阻层析纯化99mTc-zaptuzumab;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定99mTc-zaptuzumab的结合活性;用裸鼠皮下接种H460肺癌模型结合平面显像分析99mTc-zaptuzumab对肺癌的靶向性能.结果 99mTc标记zaptuzumab效率达到50％以上,纯化后99mTc-zaptuzumab的纯度达到95％以上;ELISA结果显示标记抗体保持了大部分和DR5的结合活性;平面显像显示尾静脉注射后1.5、4.5h99mTc-zaptuzumab在H460肺癌内摄取较低.结论 99mTc-zaptuzumab用Hynic法标记取得成功,抗原结合活性基本保持,但99mTc-zaptuzumab对H460肺癌靶向效果不佳.
关键词： 99mTc-zaptuzumab 显像 H460 -
131I-zaptuzumab对体外培养肿瘤细胞存活的影响
目的 为提高单克隆抗体治疗肿瘤效果,研究测试放射性核素131I标记的单克隆抗体zaptuzumab对体外培养肿瘤细胞的杀伤作用.方法 实验采用3种肿瘤细胞,分别是人A549肺腺癌、人H460大细胞肺癌和人MGC-803胃腺癌细胞.每组细胞采用4种不同的处理:分别是生理盐水、zaptuzumab、131I-zaptuzumab和131I.处理12h后用MTS法测定细胞活性,用ANO-VA分析各组之间的统计学差异,了解131I-zaptuzumab对肿瘤细胞存活的影响.结果 131I-zaptuzumab的处理使人A549肺腺癌细胞的存活率降低37.9％,而zaptuzumab和131I处理分别使人A549肺腺癌细胞的存活率降低8.7％和1.9％;131I-zaptuzumab 的处理使人H460大细胞肺癌的存活率降低53.4％,而zaptuzumab和131I处理使人H460大细胞肺癌细胞的存活率降低15.1％和18.1％;131I-zaptuzumab使人MGC-803胃腺癌存活率降低13.4％,而zaptuzumab和1311 I处理使存活率降低10.2％和8.4％.结论 131I-zaptuzumab与zaptuzumab相比,能够更有效地杀伤人A549肺腺癌和H460大细胞肺癌细胞,提示靶向死亡受体5的放射免疫治疗的可行性.
关键词： 放射性同位素碘 zaptuzumab A549 H460 MTS -
EGFP 标记的 H460细胞株建立
目的：建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的 H460细胞株，优化建系方法。方法质粒转染建立表达 EGFP 的 H460细胞株，稀释法挑选表达 EGFP 的阳性单克隆，荧光显微镜观察绿色荧光，Western blot 检测EGFP 表达，流式细胞仪分选 EGFP 表达阳性的细胞。结果成功建立稳定表达 EGFP 的 H460细胞株，其 EGFP 阳性表达率高。结论建立稳定表达 EGFP 的 H460细胞株，为以后建细胞系提供更简便有效的方法，H460-EGFP 可以作为研究工具用于后续观察抗癌新药体内的抗癌作用。
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H460小型细胞团在天然活性Ⅰ型胶原中三维立体培养模型的构建
目的:建立H460小型细胞团在天然活性Ⅰ型胶原中的三维立体培养技术.方法:实验于2006-07/11在解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科实验室(博士后工作站)完成.①实验材料:H460细胞系由解放军总医院惠赠;Wistar大鼠,体质量150～200 g,实验中的胶原仅从大鼠的尾部肌腱提取,该大鼠来源为其他科室实验过程中未做任何处理的大鼠.②实验方法:将H460小型细胞团悬液、鼠尾提取的天然胶原(4 g/L)与4倍体积的DMEM共同混合为细胞浓度2x108 L-1、胶原浓度为1 g/L、1倍体积DMEM浓度.③实验评估:倒置显微镜观察细胞团在天然胶原中的生长状态,并与平面培养细胞相比较.结果:平面培养的细胞,其细胞团生长呈分散平铺的方式,单个细胞为不规则多边行,细胞之间有明显的间隙存在,而立体培养的细胞呈团块状,周围可见放射状毛刺突起,无法观察单个细胞.结论:H460小型细胞团在天然胶原中的三维立体培养为体外研究细胞生长及肿瘤细胞生长方式提供了一个更为类似体内环境的模型.
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构建STK11基因融合质粒检测其对肺癌细胞迁移能力的影响
目的 构建表达STK11(serine/threonine kinase 11,STK11)基因和报告基因EGFP融合蛋白的重组质粒,并转染肺癌A549和H460细胞株,检测其对肺癌细胞迁移能力的影响.方法 构建重组质粒pEGFP-STK11,双酶切和测序进行鉴定.重组质粒转染A549和H460细胞株,荧光显微镜观察EGFP蛋白表达情况,Western blot检测STKll蛋白表达情况,划痕实验检测其对肺癌细胞迁移能力的影响.结果 酶切和测序结果表明pEGFP-STK11重组质粒构建成功;在转染A549和H460细胞后24h观察到绿色荧光强;Western blot结果显示STK11蛋白在转染后24 h条带深;划痕实验显示,转染组细胞迁移距离小于0.9％氯化钠溶液对照组(P＜0.05).结论 成功构建STK11基因重组质粒,并能转染A549和H460细胞,转染后对肺癌细胞迁移能力起一定抑制作用.
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PYK2介导H460肺肿瘤细胞失巢凋亡抗性的机制
[目的]研究蛋白激酶PYK2对悬浮状态下的肺癌细胞H460失巢凋亡抗性的作用和PYK2的下游通路蛋白。[方法]RNA干扰实验采用逆转录病毒载体介导的稳定表达系统降低PYK2蛋白的表达；细胞悬浮培养实验用polyHEMA培养方法：用PARP断裂带和DAPI荧光染色检测细胞凋亡情况；细胞侵袭能力用侵袭小室实验；磷酸化蛋白激酶水平用免疫印记实验检测。[结果]用RNA干扰沉默能够降低H460细胞中PYK2蛋白的表达。抑制PYK2的表达能够降低悬浮培养H460细胞增殖能力和促进细胞凋亡增加。此外，沉默PYK2的表达能使肿瘤细胞侵袭能力下降，并降低磷酸化Paxillin和Src的水平，但不能降低磷酸化JNK、AKT和ERK的水平。[结论]PYK2信号通路在H460肺癌细胞失巢凋亡抗性中起重要作用,Paxillin和Src可能是PYK2的下游通路蛋白。
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肺癌细胞与成纤维细胞、炎症细胞相互作用对MMP-1,-2,-9表达的影响
目的:研究单个核细胞、胚肺成纤维细胞和肺癌H460细胞三维立体混合培养对MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的影响,并观察MMPs对胶原的降解作用.方法:活性胶原立体培养分为空白对照组(CG)、H460细胞组(HG) 、单个核细胞组(MG) 、胚肺成纤维细胞组(FG)、H460与单个核细胞混合组(HMG)、H460与胚肺成纤维细胞混合组(HFG)、三种细胞联合培养组(HMFG)共7组,观察癌细胞的生长状况,用明胶酶谱法测定MMP-2和MMP-9表达,Western blotting 法测定MMP-1.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好;CG与MG未明显分泌MMP-1、MMP-2 和MMP-9,其余各组均分泌MMP-1、MMP-2和MMP-9,但HMFG分泌的基质金属蛋白酶明显多于其他各组. 结论: 单个核细胞、成纤维细胞和癌细胞混合培养后,细胞间相互作用促进MMPs分泌;基质金属蛋白酶可降解细胞外基质(extraclluar matrix,ECM)和其它间质组织,进而促进肺癌的侵袭和转移.
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肺癌H460细胞与单个核细胞相互作用对MMP-1、-2、-9表达的影响
目的:研究单个核细胞和肺癌H460细胞三维立体混合培养对MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的影响,并观察MMPs对胶原的降解作用.方法:活性胶原立体培养分为空白对照组(CG)、H460细胞组(HG)、单个核细胞组(MG)、混合组(HMG)共4组,观察癌细胞的生长状况.用明胶酶谱法测定不同时间点各组MMP-2和MMP-9表达,用Western blotting 法测定MMP–1.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好.MG未明显分泌MMP-1、MMP-2 和MMP-9,HG和HMG均分泌MMP-1、MMP-2和MMP-9,但HMG分泌量明显多于HG.结论:炎症细胞和癌细胞混合培养后,细胞间相互作用促进MMPs分泌增多.基质金属蛋白酶可降解细胞外基质,进而促进肺癌的侵袭和转移.
