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连续性血液净化对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤患者PYK2信号转导途径的影响
目的 观察连续性血液净化(continuous blood purification,CBP)治疗对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤患者外周血单个核细胞富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline rich tyrosine kinase2,PYK2)信号通路活化的影响,探讨CBP治疗重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤的作用机制.方法 选取深圳市宝安区人民医院肾内科、风湿免疫科和重症医学科2012年1月～2016年4月收治的重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤48例,将其随机分为观察组和对照组各24例,2组均给予常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予CBP治疗,对照组在常规治疗基础上给予间歇性血液净化(intermittent hemodialysis,IHD)治疗.比较2组患者治疗前后系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)、血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(serum creatinine,SCr)水平及治疗有效率.Western-blotting测定治疗前、治疗后7天、14天、30天患者外周血单个核细胞磷酸化PYK2蛋白(phosphorylation PYK2,p-PYK2)的表达,流式细胞术测定共刺激分子CD40L和CTLA4蛋白的表达.结果 治疗30天后,与对照组相比,观察组患者SLEDAI(3.4±2.8比7.7±2.3,t=2.334,P=0.023)、BUN (6.4±3.8比16.7±5.3,t=3.930,P＜0.001)、SCr(86.2±17.3比127.1±31.2,t=2.482,P=0.016)明显降低,差异有统计学意义;治疗后观察组有效率为91.7％,高于对照组的58.3％,差异有统计学意义(x2=4.552,P=0.013);治疗30天后,与对照组比较,观察组p-PYK2(0.732±0.206比1.110±0.152,t=3.196,P=0.007)、CD40L (9.4％比18.6％,x2=3.516,P=0.02 7)、CTLA4(7.2％比6.3％,x2=3.950,p=0.018)蛋白的表达明显降低,差异有统计学意义.结论 CBP对重型狼疮性肾炎合并急性肾损伤治疗效果明显,可以抑制患者外周血单个核细胞PYK2信号通路活化,重建机体免疫系统内稳状态,阻止肾脏病变的进一步发展,及时逆转肾功能.
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携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达
目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA,并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对pkv2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGcsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒:采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列:脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误:绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功:RT-PCR和Western blot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA细胞t'Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质pGCsi-Pyk2 shRNA.并证明他能降4Pyk2在Lovo胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.
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大鼠脑缺血后神经元中PYK2及 p38MAPK的活化及其意义
目的观察大鼠局部脑缺血后缺血区神经元中PYK2及 p38MAPK的表达并探讨其意义.方法建立大鼠局部脑缺血模型,在缺血后15、30和60min时处死大鼠,采用免疫组化方法观察大鼠缺血区神经元中PYK2及p38MAPK的表达变化.结果正常大鼠皮层仅有微量活化型PYK2和活化型p38MAPK表达.缺血15min后,皮层神经元可见活化型PYK2强免疫阳性标记,这些有活化型PYK2表达的神经元亦呈p38MAPK免疫阳性.缺血区神经元中活化型PYK2和活化型p38MAPK免疫标记在缺血30min时达到强,60min时开始减退.结论缺血可以诱发神经元中PYK2活化,既而通过p38MAPK信号转导通路介导神经元对缺血的应急反应.
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PYK2在海人酸癫痫大鼠海马神经元及小胶质细胞中的表达变化
目的观察海人酸癫痫大鼠海马内神经元和小胶质细胞中PYK2的表达并探讨其意义.方法建立海人酸大鼠癫痫模型,大鼠癫痫发作后8、24、72h后处死大鼠,采用免疫组化方法观察大鼠海马内小胶质细胞的活化状况,以及海马神经元和活化后小胶质细胞中PYK2的表达变化.结果与正常大鼠相比,癫痫大鼠中PYK2的表达在癫痫发作8h后急剧下降,并随时间推移继续下降.癫痫发作24h后,海马中出现大量呈阿米巴形状、强烈表达活化型PYK2的活化型小胶质细胞;癫痫后72h,海马中出现大量有活化型PYK2强表达的"杆"状活化型小胶质细胞.结论癫痫可致海马神经元及小胶质细胞PYK2表达变化;小胶质细胞中活化型PYK2的表达可能与小胶质细胞活化有关.
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Pyk2在胃癌组织中的表达及其意义
目的:研究Pyk2(proline-rich tyrosine kinase-2)在正常胃黏膜组织与胃癌组织中表达的差异,探讨其意义.方法:应用免疫组织化学的方法检测59例正常胃黏膜组织标本和52例胃癌组织标本中Pyk2的表达情况.结果:免疫组织化学结果显示,Pyk2在正常胃黏膜组织中的表达阳性率为86.44%(51/59),在胃癌组织中表达阳性率为19.23%(10/52),两者差异具有统计学意义(P＜0.05);在高分化胃癌中表达阳性率为47.37%(9/19),而在中、低分化胃癌中表达阳性率为3.03%(1/33),两者差异具有统计学意义(P＜0.05).Pyk2表达阳性率在不同TNM分期胃癌中分别为:Ⅰ期66.67%(6/9),Ⅱ期30%(3/10),Ⅲ期3.45%(1/29),Ⅳ期0%(0/4),差异具有统计学意义[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)vI,x2=15.767,P＜0.05)].结论:本研究观察到Pyk2在正常胃黏膜组织中有表达,在胃癌组织中低表达或几乎无表达,并且其表达随着胃癌恶性度和TNM分期的增加而逐渐降低.提示Pyk2可能在胃癌的发生、发展过程中起重要作用.
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Pyk2在系统性红斑狼疮PBMC中的表达及意义
目的 通过检测富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)在系统性红斑狼疮(SLE)中的表达,探讨Pyk2在系统性红斑狼疮发生、发展中的作用.方法 采用实时荧光定量pCR法、Western-blot法,分别从mRNA和蛋白质水平检测Pyk2在35例SLE患者和15例健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中的表达.结果 SLE活动期Pyk2的表达水平显著高于SLE非活动期和健康对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);SLE非活动期Pyk2的表达水平高于对照组(P＜0.05).结论 SLE惠者PBMC中Pyk2的表达上调,活动期患者升高更为明显,提示Pyk2可能通过作用于淋巴细胞参与SLE的发生发展.
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Pyk2在肿瘤及细胞信号通路中的研究进展
富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2,proline-rich tyrosine kinase 2)是一种非受体性酪氨酸激酶.它在多种器官和组织中表达,可以响应多种细胞内外信号而激活,参与多条信号通路的传递,能够调节细胞的迁移、增殖、分化、凋亡等.研究表明Pyk2与肿瘤发生、发展等多个过程有着密切的关系,且在不同的肿瘤组织中,Pyk2的表达处于动态变化中.因此Pyk2有可能是干预肿瘤发生发展和转移过程的新靶点,为肿瘤的治疗提供新思路.
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活化CD4+T细胞通过增进其与B细胞黏附而促进B细胞活化
采用流式细胞术建立测定CD4+T细胞和B细胞相互黏附方法,探讨CD4+T细胞活化对B细胞黏附和活化状态的影响.分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),采用磁珠分选的方法分选CD4+T细胞和B细胞后,进一步通过体外细胞黏附技术,检测并比较未经活化和经抗CD3/CD28抗体活化的CD4+T细胞与B细胞黏附能力的差异;采用流式细胞术检测培养后的B细胞中与B细胞活化相关的Pyk2分子磷酸化水平.纯化的CD4+T细胞和B细胞经体外共同培养后,可以发生直接黏附,未活化的CD4+T细胞和B细胞共同培养后,CD4+ CD19+双阳性细胞占B细胞的比例为4.024％±1.078％,经不同比例(1∶8和1∶1)抗CD3/CD28抗体活化的CD4+T细胞与B细胞作用后的CD4+ CD19+双阳性细胞的比例分别为5.560％±0.863％和8.358％±1.917％(P＜0.05),显著高于未活化组,表明活化的CD4+T细胞与B细胞之间的黏附能力显著提高,并随着CD4+T细胞活化程度的升高而增加;同时,活化的CD4+T细胞与B细胞发生黏附后,可以促进B细胞在短时间内发生活化,B细胞内Pyk2磷酸化的水平显著升高.本研究初步建立了用于分析CD4+T细胞和B细胞黏附水平的体外细胞学检测方法,研究结果显示活化的CD4+T细胞与B细胞发生黏附的能力显著增强,并且可直接促进B细胞的活化.
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氯胺酮拮抗脑缺血诱导大鼠海马脑区c-Src磷酸化及其与Pyk2的结合
目的:研究脑缺血损伤诱导非受体酪氨酸蛋白激酶Src之丝、苏、酪氨酸残基磷酸化及其与Pyk2结合的变化并探讨其可能的调节机制.方法:四动脉结扎模型诱导大鼠前脑缺血损伤,免疫沉淀和免疫印迹法观察Src氨基酸残基磷酸化及其与Pyk2结合的变化.结果:缺血15 min后复灌,Src的Tyr-416和Ser而不是Thr的磷酸化有明显增加,且复灌6h Tyr416磷酸化升至高,而Ser磷酸化1 h升至顶峰,它们分别是正常组的2.8和2.3倍;此外,缺血/复灌明显诱导Src与Pyk2的结合,相似于Tyr-416磷酸化变化,复灌6 h升至高.50mg/kg的氯胺酮能明显抑制缺血/复灌诱导的Src Tyr-416磷酸化及其与Pyk2结合增加,与对照组比有显著性差异(P＜0.05).结论:脑缺血诱导了Src蛋白激酶Ser和Tyr-416磷酸化及其与Pyk2结合,它们参与了Src的激活和NMDA受体功能的自调.
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富含脯氨酸的酪氨酸激酶2生物功能及药物研究进展
富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)为粘着斑激酶家族重要成员之一，高表达于中枢神经系统及造血系统。 Pyk2可使多种含SH2结构域的底物蛋白发生磷酸化，从而参与包括离子通道激活、应激反应、细胞黏附、骨架重组以及囊泡运输等多种信号转导通路的调节，使细胞迁移、存活、增殖等能力发生相应的改变，提示 Pyk2可能成为疾病治疗的靶点。目前针对Pyk2的药物研发主要集中在治疗癌症、骨质疏松症、免疫系统疾病等方面。该文将主要对Pyk2的结构域、调控机制及潜在的治疗作用进行综述，为其药物研发提供理论依据。
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基于Pyk2通路探讨加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠的作用
目的 基于Pyk2通路探讨加味四君子汤对阿霉素肾病大鼠的作用. 方法 将实验用SD大鼠30只采用随机数字表法分为正常组、模型组及中药组,诱导阿霉素肾病大鼠模型.中药组在阿霉素注射后第7天予中药灌胃,正常组和模型组予等量生理盐水灌胃.实验的第7、21、35天分别检测各组24 h尿蛋白定量及电镜下观察大鼠肾组织;检测各组肾组织中Nephrin、Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA、Pyk2、Pyk2磷酸化蛋白水平(pPyk2)及pPyk2/Pyk2比值. 结果 ①24 h尿蛋白定量:模型组较正常组明显升高(P＜0.01),中药组较模型组降低(P＜0.05).②Nephrin及Nephrin mRNA水平:第21、35天,模型组较正常组均明显减少(P＜0.01),中药组较模型组增高(P＜0.05).③Pyk2 mRNA水平:第21、35天,模型组和中药组比正常组均升高(P＜0.05),但第35天,中药组比模型组明显减少(P＜0.01).④pPyk2、pPyk2/Pyk2比值:第21、35天,模型组较正常组均有上升(P＜0.05和＜0.01),而中药组比模型组均有降低(P＜0.01). 结论 阿霉素可通过损伤足细胞,抑制Nephrin蛋白,激活Pyk2蛋白磷酸化引起肾病综合症的发生;加味四君子汤可抑制阿霉素肾病大鼠肾组织中Pyk2激活,上调Nephrin蛋白水平,改善肾组织足突病变,减少尿蛋白,进而保护肾小球的滤过屏障作用.
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FAK家族的新成员PYK2
PYK2是FAK家族的成员之一,是一种钙依赖性酪氨酸激酶,在氨基酸序列上与FAK性.它的活化涉及了多条信号传导通路,与离子通道的调节、细胞骨架的联系及细胞增殖、凋亡密切相关.血管紧张素Ⅱ、一氧化氮可调节PYK2的活性.
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FAK家族的新成员--Pyk2
Pyk2,FAK家族的新成员,是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶,分布于多种组织和细胞,主要依赖Ca2+浓度或PKC参与细胞内的MAPK或PI3K信号通路转导,将胞外信息传递到胞内,催化多种含SH2结构域的底物蛋白磷酸化,从而发挥重要的生理作用.Pyk2作为细胞内一种重要的效应分子,可促进基因转录,调节细胞的生长、增殖、分化,并且通过其特殊的生物学效应参与中枢神经系统、心血管系统、肾脏系统及炎症反应等疾病的发生发展,其具有重要的临床意义.
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PYK2靶向短发夹RNA干扰重组体的构建及鉴定
目的:本研究利用RNA干扰技术,以PYK2为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化机制的新途径奠定基础.方法:设计有小发夹结构的8条DNA序列,经退火成互补4对双链,再克隆到载体PAVU6+27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析.结果:酶切鉴定和测序分析均提示PYK2靶向RNA干扰重组体的构建成功.结论:PYK2靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中PYK2基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础.
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PYK2介导H460肺肿瘤细胞失巢凋亡抗性的机制
[目的]研究蛋白激酶PYK2对悬浮状态下的肺癌细胞H460失巢凋亡抗性的作用和PYK2的下游通路蛋白。[方法]RNA干扰实验采用逆转录病毒载体介导的稳定表达系统降低PYK2蛋白的表达；细胞悬浮培养实验用polyHEMA培养方法：用PARP断裂带和DAPI荧光染色检测细胞凋亡情况；细胞侵袭能力用侵袭小室实验；磷酸化蛋白激酶水平用免疫印记实验检测。[结果]用RNA干扰沉默能够降低H460细胞中PYK2蛋白的表达。抑制PYK2的表达能够降低悬浮培养H460细胞增殖能力和促进细胞凋亡增加。此外，沉默PYK2的表达能使肿瘤细胞侵袭能力下降，并降低磷酸化Paxillin和Src的水平，但不能降低磷酸化JNK、AKT和ERK的水平。[结论]PYK2信号通路在H460肺癌细胞失巢凋亡抗性中起重要作用,Paxillin和Src可能是PYK2的下游通路蛋白。
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PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响
目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6+27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.
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Pyk2在细胞功能活性调控中的作用
Pyk2,即粘着斑激酶家族新成员,与FAK具有高度同源性,广泛表达于多种组织和细胞,主要通过受外界一系列因素的刺激并依赖于Ca2+浓度的变化将胞外信号传导到胞内,从而发挥生物学效应.同时催化多种含SH2和SH3结构域的底物磷酸化,进一步参与细胞骨架的重组、细胞粘附、生长、迁移、增殖、分化、细胞凋亡及基因转录等各项功能活性的调控.
