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RNA 干扰技术及其在子宫内膜容受性研究中的运用
基因沉默（gene silencing）是指生物体内的特定基因由于种种原因不表达或者表达量极低，是真核细胞调节基因表达的重要手段。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是基因沉默技术的重要组成部分，现已成为在基因功能研究、基因表达调控、基因治疗等方面诱导下调、抑制特异性的基因表达不可或缺的工具。在探索子宫内膜容受性生物标记物的相关研究中，RNA 干扰对基因功能的定位也具有重要作用。本文概述 RNA 干扰技术的发展、作用机制及其方法学的研究进展，以及在子宫内膜容受性研究中运用基因沉默技术取得的研究进展。
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增殖抑制基因（HSG）RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定
目的：为研究 HSG 基因不同表达程度对肺癌细胞的影响，构建并鉴定 HSG 基因 RNA 干扰慢病毒表达载体，以建立 HSG 基因沉默的人肺癌细胞株。方法针对 HSG mRNA 设计了4条 siRNA，并构建 pGCSIL-GFP-HSG 慢病毒质粒，通过测序鉴定。采用构建的 pGCSIL-GFP-HSG，pHelper1.0和pHelper2.0共感染293T 细胞，包装产生慢病毒，测定其滴度。将慢病毒转染人肺腺癌细胞株 A549，通过 real-time PCR 分析 HSG 基因表达。结果测序结果显示，DNA 序列与实验要求序列一致，提示插入人HSG 基因 RNAi 序列正确。荧光显微镜观察转染慢病毒包装质粒后的细胞，见细胞生长良好，荧光强度强烈。测定病毒滴度为3×108 TU / ml。real-time PCR 分析提示 RNA 干扰病毒感染 A549细胞株后，HSG基因表达显著下调。结论人 HSG 基因 RNAi 慢病毒载体构建成功，可用于肿瘤学的进一步应用。
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外源性双链RNA在蚊虫细胞中介导的基因沉默
目的近年来,双链RNA介导的基因沉默(RNA干扰)已在许多动植物中发现,并成为研究基因功能的强有力的工具.为确定蚊虫细胞中是否有RNA干扰现象,以期为利用RNAi效应消除蚊虫抗药性研究奠定基础. 方法设计5′端带T7启动子的绿色荧光蛋白(GFP)及糜蛋白酶特异性引物,PCR扩增目的基因获得5′端带有T7启动子DNA片段,体外转录成单链RNA,退火后形成双链RNA.转染带有GFP基因的昆虫细胞表达载体pAct.GFP和双链RNA进入C6/36 蚊虫细胞,72 h后收集细胞,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达差异,用半定量RT-PCR检测GFP的mRNA的表达水平. 结果转染糜蛋白酶基因双链RNA和pAct.GFP质粒的细胞及仅转染pAct.GFP的细胞的GFP表达水平没有明显差异;转染GFP基因的双链RNA和pAct.GFP质粒的细胞的GFP表达水平显著下降,达40%～50%,GFP的mRNA的表达水平也相应下降了60%. 结论在蚊虫细胞内,双链RNA能特异性的抑制相应的同源性基因的表达,引起基因沉默,证实蚊虫细胞内RNA干扰现象的存在.
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ski基因干扰对人视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响
目的：设计并化学合成针对ski的siRNA分子片段，转染人视网膜色素上皮（hRPE）细胞抑制ski表达，观察其对hRPE细胞增生和迁移等生物学功能方面的影响。方法设计并化学合成3对针对人ski mRNA(NM_003036)中910、1912和389靶位的siRNAs，以脂质体方法转染hRPE细胞，运用RT-PCR法和Western印迹法检测细胞中ski基因在mRNA水平和蛋白水平的变化。然后利用MTT法和Transwell模型检测转染ski-siRNA的hRPE细胞增生活力和迁移能力等生物学功能方面指标的变化。结果 RT-PCR和Western印迹检测结果证实3条ski-siRNA转染48 h后，均不同程度降低了hRPE细胞中ski基因的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05)，其中siRNA-C的干扰效果强，与阴性对照相比抑制率达到45%左右，被用于后续生物学功能实验的转染。转染ski-siRNA后2～6 d hRPE细胞的增生能力明显受到抑制(P＜0.05)。与空白对照组和NC组相比，在培养12 h和24 h时，siRNA-C转染hRPE细胞迁移数量明显升高(P＜0.01)。结论 siRNA-C (389)是可以高效、特异地沉默hRPE细胞中ski基因。靶向ski基因的siRNA转染可以有效地抑制hRPE细胞增生，但可能促进细胞迁移。ski对hRPE增生和迁移调控可能是PVR治疗的一个新的方向。
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RNA 干扰巨噬细胞移动抑制因子对宫颈癌 Caski 细胞上皮-间质转化的影响
目的：通过 RNA 干扰技术研究巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对宫颈癌 Caski 细胞上皮-间质转化（EMT）的影响作用。方法通过构建重组真核表达载体 pGenesil-1-MIF siRNA，转染宫颈癌 Caski 细胞（Caski-pGenesil-MIF siRNA 组），同时设空载体转染组（Caski-pGenesil-1组）和空白对照组（Caski 组），采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测 Caski 细胞中 MIF mRNA 相对表达量的变化，并检测转染前后 Caski 细胞中 EMT 相关指标E-cadherin 和 Vimentin 的表达变化。结果 pGenesil-1-MIF siRNA 转染 Caski 细胞后 MIF mRNA 的表达量减少，低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RNA 干扰抑制 MIF 基因表达后，与对照组相比，pGenesil-1-MIF siRNA 组 Caski 细胞上皮标记物 E-cadherin mRNA 及蛋白表达水平上调（P＜0.05），间叶标记物 Vimentin mRNA 及蛋白表达水平显著下调（P＜0.05）。结论抑制 MIF基因表达可抑制宫颈癌 Caski 细胞发生 EMT 的能力。
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RNA干扰对脂联素在3T3-L1脂肪细胞中表达的影响
设计合成3对ACRP30编码基因的反向重复序列,分别定向克隆至载体psilencer 1.0的U6启动子下游,构建了相应的shRNAs表达质粒,并证实了这些重组质粒对成熟脂肪细胞中脂联素蛋白的表达有显著的抑制作用.
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RNA干扰技术建立细丝蛋白表达下调的血管平滑肌细胞模型
目的 利用RNA干扰(RNAi)技术使细丝蛋白(FLN)mRNA表达降低,抑制FLN在血管平滑肌细胞(VSMC)中的生成.方法 采用RNAi技术建立FLN表达下调VSMC模型,设计3条可诱发FLN mRNA表达基因沉默的小分子RNA(SiRNA)片段,根据构建质粒载体并转染VSMC的不同,建立7-1、7-2、7-3组和正常对照组、空白载体组5组转染细胞模型,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白标记物的表达并鉴定转染效率,荧光定量PCR鉴定FLN mRNA抑制效果.Western blot检测FLN蛋白的表达.结果 设计的3条SiRNA均可有效抑制FLN mRNA的表达.其中7-1和7-2组抑制效果明显,可达60%以上.3组FLN/肌动蛋白(actin)的比值与正常对照组或空白载体组相比较均明显下降.结论 利用RNAi抑制FLN在VSMC中的生成,有可能减少病理状态下收缩表型VSMC向合成表型转化.有可能达到从基因水平上预防或治疗动脉粥样硬化的作用.
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人腺苷酸活化蛋白激酶5基因 RNA 干扰慢病毒载体的构建及其对人胃癌 SGC7901细胞生物学行为的影响
目的：探讨人腺苷酸活化蛋白激酶5（ARK5）基因 RNA 干扰（RNAi）慢病毒载体的构建及其对人胃癌 SGC7901细胞生物学行为的影响。方法以人 ARK5 mRNA 编码序列为干扰靶点，设计3条沉默 ARK5的特异性短发卡 RNA（shRNA），构建重组慢病毒表达载体，转染人胃癌 SGC7901细胞。采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 ARK5基因的沉默效果，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell 法检测细胞侵袭能力，流式细胞仪检测葡萄糖饥饿和肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导处理对细胞凋亡的影响。结果测序结果证明， RNAi 重组慢病毒载体 ARK5－shRNA－3构建成功。实时荧光定量 PCR 检测显示，正常对照组、阴性对照组和 ARK5－shRNA－3转染组的 ARK5基因表达水平分别为1．002±0．082、1．001±0．050和0．140±0．003。 ARK5－shRNA－3转染组与正常对照组、阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。细胞划痕实验显示，ARK5－shRNA－3转染组的细胞迁移率为（38．5±4．3）％，而正常对照组和阴性对照组的细胞迁移率分别为（72．4±6．4）％和（75．1±7．1）％，差异有统计学意义（P＜0．01）。 Transwell 检测结果显示，正常对照组、阴性对照组和 ARK5－shRNA－3转染组的穿膜细胞数分别为（257．4±12．3）个、（245．7±11．6）个、（112．5±7．8）个，ARK5－shRNA－3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义（P＜0．01）。在葡萄糖饥饿和 TNF－α处理24 h 后，正常对照组、阴性对照组和 ARK5－shRNA－3转染组的细胞凋亡率分别为（11．7±3．2）％、（12．3±2．6）％和（30．8±4．3）％，ARK5－shRNA－3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义（P＜0．01）。结论成功构建了能高效沉默 ARK5基因的重组慢病毒表达载体，并且明显地抑制了胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进了胃癌细胞在饥饿胁迫及 TNF－α诱导情况下的凋亡。
关键词： 胃肿瘤 腺苷酸活化蛋白激酶 5 RNA 干扰 慢病毒感染 葡萄糖饥饿 -
载体介导的RNAi技术对HL-60细胞hTERT基因、蛋白表达和细胞增殖的影响
目的：探讨载体介导的靶向人端粒酶反转录酶（htert）基因 rna 干扰（rnai）对白血病 Hl-6细胞 htert 基因、蛋白表达和细胞增殖的影响。方法采用靶向 htert 基因 rnai 的重组质粒 psilecer1.0-U6/htert 转染 Hl-60细胞,以空载体质粒 psilecer1.0-U6转染组、转染试剂及空白组作对照，将转染后24h、72h、120h 的细胞用 rt-Pcr 检测细胞 htert 基因 mrna 的表达，Western-blot 检测细胞 htert 蛋白的表达，Mtt 检测细胞增殖活性。结果转染psilecer1.0-U6/htert 质粒24h、72h 和120h 后，Hl-60细胞 htert 基因、蛋白表达水平均低于各对照组（p ＜0.05），细胞增殖抑制率高于各对照组（p ＜0.05）。htert 基因、蛋白和细胞增殖抑制率在转染 psilecer1.0-U6/htert 质粒24h、72h 和120h 组间无明显差异（p ＞0.05），在3个对照组间也无明显差异（p ＞0.05）。结论载体介导的靶向htert 基因的 rnai 技术能在体外抑制 Hl-60细胞 htert 基因和蛋白的表达，增加细胞凋亡，抑制增殖。
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RNA 干扰沉默 IGF1R 表达对 A549细胞放射增敏作用的研究
目的：构建靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)-siRNA 重组慢病毒表达载体,观察其对人肺腺癌 A549细胞放疗增敏作用并探讨其机制。方法构建 IGF1R-siRNA 重组慢病毒,感染 A549细胞,蛋白免疫印迹法检测 IGF1R 沉默效率；荧光实时定量 PCR 法及 ELISA 法分别检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和 Bad 基因及蛋白表达情况。克隆形成实验检测放射增敏作用。结果 IGF1R-siRNA 重组慢病毒使 A549细 胞 IGFlR 蛋白沉默效率达70.53%；HIF-1α、VEGF和 Bad 基因及蛋白表达量均显著降低；A549细胞对放射治疗的敏感性增加,平均致死剂量由1.20 Gy 下降至0.94 Gy,放射增敏比达1.28。结论沉默 IGF1R 对人肺腺癌 A549细胞具有放疗增敏效应,其机制可能与 HIF-1α、VEGF 和 Bad 表达下调相关。
关键词： 胰岛素样生长因子1受体 慢病毒载体 放疗增敏 RNA 干扰 A549 细胞 -
ERCC1与非小细胞肺癌铂类耐药的研究进展
肺癌是世界上发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％,并且新发病例中70％以上是ⅢB-Ⅳ期患者,手术切除率低,化疗成为治疗晚期NSCLC的主要方法.以顺铂为基础联合第3代化疗药物(紫杉醇、吉西他滨等)组成的化疗方案是目前治疗NSCLC的标准化疗方案,但其有效率亦仅25％-30％左右,2年生存率不到15％[1].近年来,对于肺癌的化疗的疗效虽有所提高,但其联合治疗的有效率也只有30％-40％.究其原因,与肿瘤细胞对铂类化疗耐药有关[2],从而影响其预后.
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RNA 干扰在肿瘤治疗中的研究进展
恶性肿瘤是威胁人类健康的一大杀手，目前所采取的手术、放化疗等治疗措施效果并不理想。本文介绍了 RNA 干扰（RNAi）的相关作用机制及其在肿瘤治疗中的应用，并叙述了 RNAi 用于治疗时的递送方式、引起的脱靶效应和免疫反应，提示 RNAi 用于治疗时存在的一些问题，通过进一步的研究，基于 RNAi 的肿瘤治疗有望成为一种肿瘤治疗新方法。
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含人 LINGO -1慢病毒干扰载体的构建与鉴定
目的：体外构建含人 LINGO -1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因 LINGO -1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据 GenBank 数据库中报道的人 LINGO -1基因序列，设计合成针对人 LINGO -1短发夹 RNA （LINGO -1 shRNA）干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T 细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组（实验组）和错配序列干扰载体组（对照组），并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率，并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测 LINGO-1 mRNA 表达水平，采用 Western blotting 法检测 LINGO -1 表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108 TU/ ml 和4×108 TU/ ml 的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞 U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6％、95.2％。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞 U251高表达 LINGO -1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组 LINGO -1 mRNA 表达水平（0.09±0.01）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝12.87，P ﹤0.01），实验组 LINGO -1 mRNA 相对表达抑制率为91.0％。实验组 LINGO -1 表达水平（0.28±0.02）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝-8.13，P ﹤0.01）。结论本研究成功构建了含人 LINGO -1 shRNA 干扰载体，并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果，为研究 LINGO -1 在轴突再生中的作用奠定了基础。
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Gab2的表达及其对胃癌细胞增殖的影响
目的：探讨 Gab2在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖的影响。方法应用免疫组织化学的方法检测65例胃腺癌中 Gab2的表达，将含 Gab2-siRNA 的载体质粒转染胃癌细胞 BGC-823，用蛋白印迹法检测胃癌细胞中 Gab2蛋白表达水平的变化，用噻唑蓝（MTT）法检测肿瘤细胞增殖情况，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法（TUNEL）检测细胞凋亡情况。结果Gab2在胃腺癌中过表达，阳性表达率为69％，而在正常胃黏膜中低表达，转染 Gab2-siRNA 后，Gab2蛋白表达水平显著降低，肿瘤细胞的增殖受到抑制，细胞凋亡率达到42．34％（P ＜0．05）。结论Gab2在胃腺癌中过表达，靶向 Gab2的 RNA 干扰能够有效地抑制胃癌细胞的增殖，并促进其凋亡，因此其可能在胃癌的发生发展中起着重要作用。
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携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响
背景：端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用，利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的：利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞，并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法：原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组，转染后并测其转染率，且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论：端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示，端粒酶反转录酶基因 siRNA 慢病毒载体转染组在转染后24-48 h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明，携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。
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△Np73小干扰 RNA 表达质粒抑制人乳腺癌细胞株 MCF-7增殖
目的：应用小干扰 RNA 技术抑制△Np73表达，探讨其对人乳腺癌细胞株 MCF-7增殖的影响。方法制备△Np73小干扰表达质粒，脂质体法转染人乳腺癌细胞株 MCF-7；荧光显微镜下观察转染细胞绿色荧光蛋白表达，计算转染效率； MTT 法检测转染质粒后细胞增殖抑制率；实时荧光定量 PCR 检测细胞转染质粒后△Np73和 TAp73 mRNA 的表达；共转染 pcDNA3-HA/ DNp73α表达质粒与△Np73小干扰质粒， Western Blot 检测细胞转染后△Np73和 TAp73表达。结果成功构建并转染△Np73小干扰表达质粒，转染效率达62%。经△Np73质粒干扰的细胞增殖活性显著下降，与阴性对照组相比差异显著。△Np73小干扰质粒转染细胞能有效抑制内源性△Np73 mRNA 和外源性△Np73蛋白表达，对 TAp73无显著抑制作用。结论针对△Np73基因设计的小干扰 RNA 表达质粒能显著降低 MCF-7细胞中△Np73 mRNA 及蛋白的表达，抑制细胞生长增殖，表明靶向沉默△Np73可能为未来人乳腺癌的治疗提供了一个有效途径。
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大鼠PAX2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及沉默效果
目的：构建PAX2特异性shRNA 干扰慢病毒载体并观察其对大鼠肾小管上皮细胞（ NRK52E）中PAX2基因的沉默效果。方法采用PAX2基因 RNAi靶点序列合成靶序列的 Oligo DNA，退火形成双链 DNA，与pGCSIL-GFP载体连接产生 shRNA慢病毒载体，经 PCR筛选阳性克隆进行 DNA 测序鉴定。用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞，将包装产生的慢病毒颗粒感染NRK52E 细胞，RT-PCR、Western 印迹检测PAX2 mR-NA 和蛋白的表达。结果 PCR与DNA测序证实合成的含PAX2 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。经RNA干扰后的靶细胞PAX2 mRNA及蛋白表达水平明显降低。结论成功构建人PAX2基因RNA干扰慢病毒载体，为以PAX2基因为靶点的梗阻性肾病基因治疗研究奠定了基础。
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沉默 G250基因对肾癌786－0细胞移植瘤 Skp2表达的影响
目的：探讨沉默 G250基因对肾癌786－0细胞移植瘤 S 期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法构建靶向 G250的 siRNA 表达质粒 pshRNA－G250并转染肾癌786－0细胞，12只 BALB ／c 裸鼠分为阴性对照组和干扰成瘤组，干扰成瘤组每只裸鼠皮下接种5×106个 G250基因沉默后的肾癌786－0细胞（786－0／si－G250－b），以转染空质粒的细胞（786－0／si－G250－0）为对照。成瘤3 w 后，处死裸鼠后切取瘤块，采用组织芯片技术及免疫组化 SP 法检测 Skp2的表达。结果5×106个细胞皮下接种 BALB ／c 裸鼠3 w 后均成瘤，Skp2在阴性对照组和干扰成瘤组裸鼠的肿瘤组织中表达率分别为83．33％（5／6）和16．67％（1／6），两者有显著性差异（P ＝0．04）。结论 G250基因表达沉默抑制了肾癌细胞移植瘤 Skp2的表达。
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RNA 干扰血管紧张素原基因表达对前脂肪细胞3T3-L1分化的影响
目的：构建靶向血管紧张素原（AGT）基因的 RNA 干扰质粒，研究 AGT 基因对鼠前脂肪3T3-L1分化的影响。方法：设计靶向 AGT 的小分子 RNA 干扰片段（AGT-shRNA），以未靶向任何 DNA 的小分子RNA （Non-shRNA）为对照，利用载体 psiRNA-U6.1／Neo 构建重组表达质粒，转染鼠前脂肪细胞3T3-L1并筛选到稳定转染细胞株，RT-PCR 和 SDS-PAGE 法分别检测 AGT 基因沉默效果，通过显微镜观察和脂肪细胞分化标志物检测来确定 AGT 基因干扰对3T3-L1细胞分化的影响。结果：成功构建 AGT 干扰质粒，与对照组比较， AGT 基因转录水平受到显著抑制（P ＜0.05），AGT 蛋白表达水平也仅为对照的43.86％。AGT 基因干扰后3T3-L1细胞脂质水平和甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）活性仍随分化时间延长呈上升趋势，但增长量明显低于对照组（P ＜0.05）。结论：RNA 干扰 AGT 基因可明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，提示脂肪组织中的肾素-血管紧张素系统（RAS）与脂肪代谢有重要关联。
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siRNA 沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响
目的：利用 siRNA 干扰技术研究胸腺素β4（Tβ4）基因沉默对鹿茸间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法鹿茸 MCS 分为阴性对照组、siRNA-Tβ4转染组2组。MTT 检测 MSC 增殖的变化，Real-time PCR 检测 ILK、AKT 及 CyclinD1 mRNA 表达量差异变化，Western blot 检测 AKT 及 P-AKT 蛋白含量变化。结果 siR-NA-Tβ4转染组 MSC 增殖受到显著抑制（P ＜0.01）；siRNA-Tβ4转染组 ILK、CyclinD1 mRNA 表达量下调，AKT mRNA 表达量不变；siRNA-Tβ4转染组总 AKT 蛋白含量无变化，P-AKT 蛋白含量减少。结论 Tβ4基因沉默能显著抑制 MSC 增殖，并可能通过下调 ILK、P-AKT 及细胞周期相关蛋白 CyclinD1从而抑制 MSC 细胞增殖。
关键词： RNA 干扰 Tβ4 间充质干细胞 ILK/ AKT 信号通路
