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RNA 干扰沉默 IGF1R 表达对 A549细胞放射增敏作用的研究
目的：构建靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)-siRNA 重组慢病毒表达载体,观察其对人肺腺癌 A549细胞放疗增敏作用并探讨其机制。方法构建 IGF1R-siRNA 重组慢病毒,感染 A549细胞,蛋白免疫印迹法检测 IGF1R 沉默效率；荧光实时定量 PCR 法及 ELISA 法分别检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和 Bad 基因及蛋白表达情况。克隆形成实验检测放射增敏作用。结果 IGF1R-siRNA 重组慢病毒使 A549细 胞 IGFlR 蛋白沉默效率达70.53%；HIF-1α、VEGF和 Bad 基因及蛋白表达量均显著降低；A549细胞对放射治疗的敏感性增加,平均致死剂量由1.20 Gy 下降至0.94 Gy,放射增敏比达1.28。结论沉默 IGF1R 对人肺腺癌 A549细胞具有放疗增敏效应,其机制可能与 HIF-1α、VEGF 和 Bad 表达下调相关。
关键词： 胰岛素样生长因子1受体 慢病毒载体 放疗增敏 RNA 干扰 A549 细胞 -
RNAi沉默VEGF-C对A549细胞VEGF家族因子及其受体和下游信号通路的影响
目的：研究沉默血管内皮生长因子（ VEGF）-C对人非小细胞肺癌（ NSCLC） A549细胞 VEGF家族因子及其受体和下游信号通路的影响。方法构建靶向VEGF-C基因的重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C，将其感染A549细胞，建立 VEGF-C基因低表达的 A549细胞。 ELISA法检测肿瘤细胞VEGF-C蛋白的分泌，Western印迹检测 Lv-siRNA-VEGF-C 细胞组、空载体 Lv-Con 对照组及空白 A549细胞中 VEGF 家族因子 VEGF-C、VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3蛋白的表达，及下游 ERK、AKT和 p38信号通路的磷酸化活性。结果成功构建靶 VEGF-C 基因的干扰表达载体PSIH1-VEGF-C-siRNA，包装形成重组慢病毒 Lv-siRNA-VEGF-C，以慢病毒转染 A549建立 VEGF-C基因低表达细胞。与对照组相比，VEGF-C低表达组细胞中VEGF-C蛋白的表达和分泌显著降低，VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3的表达也显著降低。同时，VEGFR-2和 VEGFR-3的磷酸化水平显著降低，并且VEGFR-2和VEGFR-3介导的下游信号分子ERK、AKT和p38的磷酸化水平亦明显降低（P＜0.01）。结论慢病毒介导的VEGF-C基因沉默能抑制人非小细胞肺癌A549细胞VEGF家族因子VEGF-C、VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3蛋白的表达及下游ERK、AKT和 p38信号通路的磷酸化活性。
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六神丸含药血清对人肺癌 A549细胞凋亡及凋亡相关表达的影响
目的：研究六神丸含药血清对人肺癌 A549细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响，探讨六神丸治疗肺癌的作用机制。方法：制备不同浓度的六神丸含药血清，应用流式细胞仪观察细胞凋亡情况，采用逆转录-聚合酶链反应法（ RT-PCR）检测survivin mRNA表达情况。结果：六神丸含药血清对A549细胞增殖有明显抑制作用，促使A549细胞发生凋亡，并能下调survivin的表达，其作用与药物浓度呈正相关，与顺铂（ DDP）联合用药有协同作用。结论：六神丸治疗肺癌的作用机制可能与其能下调survivin的表达，诱导A549细胞凋亡有关。
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5－氮－2′－脱氧胞苷对肺癌A549细胞凋亡及范可尼贫血互补基团F表达的影响
目的：探讨5－氮－2′－脱氧胞苷（5－Aza－CdR）对人肺癌 A549细胞凋亡及抑癌基因范可尼贫血互补基团F（FANCF）基因表达的影响。方法以浓度为0．5、5、50μmol／L 的5－Aza－CdR 处理人肺癌细胞株 A549，常规培养采用四唑盐（MTT）比色法观察细胞的生长活性，甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）检测 FANCF 基因甲基化状态；以荧光定量 PCR 检测 FANCF mRNA 的表达，并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果5－Aza－CdR 能明显抑制肿瘤细胞的生长，细胞增殖抑制率（CPIR）随5－Aza－CdR 浓度和作用时间的不同而变化，呈剂量依赖性（P ＜0．005）和时间依赖性（P ＜0．001）；药物处理后 FANCF mRNA 表达明显升高，细胞凋亡率与5－Aza－CdR 剂量呈正相关（r ＝0．998， P ＜0．05）。结论5－Aza－CdR 能使 FANCF 基因去甲基化，促进细胞凋亡，增强抑癌功能，但同时有增加顺铂耐药的风险。
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矢车菊黄素诱导 A549细胞凋亡及机制研究
目的：研究矢车菊黄素对 A549细胞增殖及凋亡的影响及其机制。方法采用 MTT 法测定 A549细胞增殖，Hochest 染色检测细胞凋亡，流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期，Western blot 方法检测细胞中 NF-κB P65蛋白的表达。结果矢车菊黄素剂量依赖性抑制 A549细胞的增殖，半数抑制浓度（IC50）值为0．67μmol·L－1；剂量依赖性诱导 A549细胞凋亡，0．15、0．30μmol·L－1矢车菊黄素处理时诱导细胞发生 G1期阻滞；剂量依赖性上调 A549细胞中 NF-κB P65的表达。结论矢车菊黄素能诱导 A549细胞的凋亡，其促凋亡作用可能与 NF-κB 信号通路激活有关。
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大气细颗粒物不同成分对 A549细胞遗传毒性的影响
目的：研究大气细颗粒物（PM2．5）不同成分对人肺腺癌Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）遗传毒性的影响，探索 PM2．5暴露的细胞毒性机制及发病机制，为开展河南地区 PM2．5的健康危害评估提供实验依据。方法：于郑州市采集并处理 PM2．5非水溶性成分和水溶性成分，分为 PM2．5非水溶性和水溶性成分不同浓度（50、100、200、400、800 mg／L）染毒组和对照组，采用 CCK－8比色法测量 A549细胞在染毒后6、12、24、48和72 h 的细胞存活率，微核实验检测各个浓度染毒24 h 后细胞染色体损伤情况。结果：PM2．5非水溶性和水溶性成分均能抑制 A549细胞增殖（P ＜0．05）。染毒24 h 时800 mg／L 的大气 PM2．5非水溶性成分或染毒48 h 时800 mg／L 的大气 PM2．5水溶性成分作用下细胞存活率低。 PM2．5非水溶性成分和水溶性成分均能诱导 A549细胞染色体损伤，与对照组相比，实验组微核率明显升高（P ＜0．05），非水溶成分致细胞微核率较高（P ＜0．05）。结论：PM2．5能抑制 A549细胞增殖，导致 A549细胞染色体损伤。非水溶成分的影响可能更大。
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扶正解毒方对肺腺癌 A549细胞生长及凋亡的影响
目的：探讨扶正解毒方对肺腺癌 A549细胞生长及凋亡的作用。方法：将10只大耳白兔随机分为扶正解毒方高剂量组、中剂量组、低剂量组，对照组，环磷酰胺（ CTX）组5组，每组各2只。扶正解毒方高剂量组、中剂量组、低剂量组分别按16 g·kg -1、8 g·kg -1、4 g·kg -1剂量口服灌胃；对照组给予相同剂量生理盐水，每日1次，连灌1周；环磷酰胺（CTX）组第1天予20 mg ·kg -1腹腔注射。末次用药后1 h，各组均在无菌条件下心脏采血，分离血清。采用血清药理学方法，对 A549细胞株进行体外培养，然后分别加入扶正解毒方高剂量、中剂量、低剂量含药血清、对照组含药血清、CTX 含药血清，通过光学显微镜直观法、细胞计数法、MTT 法、流式细胞仪法等对 A549细胞生长及凋亡指标进行测定。结果：A549细胞在显微镜下呈现典型的凋亡形态学改变；细胞生长曲线提示，扶正解毒方对 A549细胞的抑制作用呈明显时效和量效关系；MMT 法提示，扶正解毒方对 A549细胞生长的抑制率随浓度的增加而增加，呈效应-剂量依赖关系；流式细胞仪检测显示，细胞凋亡率随着药物剂量的增加和作用时间的延长而增加，药物作用72 h 后，扶正解毒方低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率分别为（6.30±1.01）%、（15.72±1.54）%、（23.40±1.34）%，与对照组比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。结论：扶正解毒方可抑制肺腺癌 A549细胞生长、诱导细胞凋亡。
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裸鼠肺癌移植瘤中 S100A2表达的研究
目的：研究通过肺腺癌 A549细胞构建的裸鼠肺癌组织中 S100A2的表达。方法将30只裸鼠随机平均分为对照组及处理组，处理组采用气管内注入 A549细胞的方法构建裸鼠肺癌动物模型，对照组换用等量氯化钠注射液。通过实时荧光定量 PCR 法和 Western - blot 法检测肺癌组织中 S100A2 mRNA 和 S100A2蛋白的相对表达量。结果对照组裸鼠死亡1例，处理组小鼠死亡3只。处理组裸鼠成功构建肺癌模型。处理组肺癌组织中S100A2 mRNA 相对表达量是对照组的（2.126±0.076）倍，差异有统计学意义（P ＜0.05）。处理组肺癌组织中S100A2蛋白的相对表达量较对照组升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论裸鼠肺癌组织中 S100A2的表达增高，为 S100A2成为肺癌患者筛查的标志物提供了实验室依据。
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香烟烟雾提取物对肺腺癌 A549细胞中 S100A2表达的影响
目的：研究香烟烟雾提取物对肺腺癌 A549细胞中 S100A2表达的影响。方法用含3%香烟烟雾提取物的培养基处理肺腺癌 A549细胞，对照组培养基不含香烟烟雾提取物。分别收集培养1、2、3周的细胞，采用实时荧光定量 PCR 法和 Western-blot 法检测各组细胞中 S100A2 mRNA 和 S100A2蛋白的相对表达量。结果经香烟烟雾提取物处理1、2、3周后，肺腺癌 A549细胞中 S100A2 mRNA 表达量逐渐增加，各处理组细胞 S100A2 mRNA相对表达量分别是对照组的（1.729±0.067）、（2.420±0.106）、（3.368±0.105）倍，差异有统计学意义（ F =140.441，P =0.000）。各组 A549细胞中 S100A2蛋白相对表达量分别为0.352±0.007、0.525±0.009、0.590±0.013，与对照组的0.241±0.006相比，差异有统计学意义（F =1941.418，P =0.000）。结论经香烟烟雾提取物可促进 A549细胞中 S100A2表达增高，为 S100A2成为吸烟的肺腺癌患者筛查的标志物提供了实验室依据。
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4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响
目的：研究4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮对 A549细胞增殖、凋亡的影响。方法用含3%4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮的培养基处理肺腺癌 A549细胞，分别收集培养1周、2周、3周的细胞，采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖特性，Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡。结果对照组 A549细胞培养3周后吸光度差异未见统计学意义（F ＝0.554，P ＝0.650），经4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮处理1周、2周、3周后 A549细胞吸光度分别为（0.516±0.007）、（0.485±0.005）、（0.432±0.013），差异有统计学意义（ F ＝171.804，P ﹤0.001），各处理组与对照组吸光度比较差异有统计学意义（P 均﹤0.001）。随着4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮对 A549细胞作用时间的增加，增殖抑制率逐渐增加，分别为（22.28±1.58）%、（27.06±0.70）%、（34.60±2.18）%，差异有统计学意义（F ＝169.77，P ﹤0.001）。4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮可诱导 A549细胞的凋亡，随着作用时间的延长，各处理组细胞凋亡率逐渐增加，分别为（16.32±0.93）%、（22.92±1.11）%、（29.88±0.81）%，与对照组[（10.22±1.29）%]相比，差异有统计学意义（F ＝387.171，P ﹤0.001）。结论4-N-亚硝基甲基氨-1-（3-吡啶基）丁酮可抑制 A549细胞的增殖，并促进其凋亡。
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奥曲肽对 LPS 处理的 A549细胞代谢的影响
目的：探讨生长抑素衍生物奥曲肽对脂多糖（LPS）诱导 A549细胞代谢组学变化的影响。方法：体外培养肺泡腺癌上皮细胞 A549，分别经 LPS 和 LPS ＋奥曲肽处理，气相色谱质谱联用技术（gas chromatography／mass spectrometry， GC／MS）和液相色谱质谱联用技术（liquid chromatography／mass spectrometry， LC／MS）检测 A549细胞在不同处理条件下的代谢组变化，对结果进行色谱图可视化检查，将相应数据进行主成分分析（PCA），解析其差异表达代谢物，并构建互作网络图。结果：（1）在基于 LC／MS 方法的代谢组分析中，发现不同处理组之间有一定差异，进一步采用正交潜变量投影判别分析（OPLS－DA），获得差异性表达代谢物。差异代谢物以氨基酸类及磷脂类为主。（2）通过 GC／MS 技术分析不同处理 A549细胞的代谢组，获得差异性表达代谢物，主要为有机酸，糖类及氨基酸类代谢产物。（3）构建互作网络图，主要涉及糖酵解／糖异生、色氨酸代谢、半乳糖代谢、尿素循环和柠檬酸代谢，并从中发现14个具有标志性代谢物作用的关键成分，包括5－羟色胺、吲哚、苏氨酸、丝氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、乳糖、延胡索酸盐、4－羟基苯乳酸、冬氨酸盐、天门冬素、腐胺、脯氨酸和琥珀酸盐。结论：（1）代谢组分析发现，在奥曲肽处理 LPS 刺激的 A549细胞的过程中，有机酸，糖类、氨基酸类和脂类是其变化的主要成分。（2）构建了 LPS 致 A549细胞炎症反应和奥曲肽干预作用的差异代谢物互作网络图，涉及5个代谢路径和14个关键代谢组分。
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盐酸戊乙奎醚抑制白细胞介素-1β诱导A549细胞分泌细胞间黏附分子-1及其机制的研究
目的：探讨盐酸戊乙奎醚（PHC）抑制白细胞介素-1β（IL-1β）诱导 A549细胞分泌细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及其作用机制。方法体外培养 A549细胞株，分别用培养液（A 组）、PHC （B 组）、IL-1β（C 组）和 IL-1β＋PHC（D 组）处理，NF-κB DNA 结合活性试剂盒检测刺激后1 h NF-κB DNA 结合活性；反转录-聚合酶链反应检测刺激后4 h ICAM-1 mRNA 表达；酶联免疫吸附法检测刺激后24 h ICAM-1蛋白表达。结果IL-1β刺激后，C 组 NF-κB DNA 结合活性、ICAM-1 mRNA 和蛋白明显升高（P ＜0．01），D 组 NF-κB DNA 结合活性、ICAM-1 mRNA 和蛋白高于 A 组（P ＜0．05），但低于 C 组（P ＜0．05），PHC 预处理能抑制 IL-1β诱导的 NF-κB DNA结合活性、ICAM-1 mRNA 和蛋白表达升高。结论PHC 可抑制 IL-1β诱导 A549细胞分泌 ICAM-1，其机制可能通过抑制 NF-κB 激活。
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esp1基因上调表达对A549细胞凋亡影响的研究
目的观察A549细胞转染esp1基因后细胞凋亡情况.方法将含esp1 基因的IRE-EGFP 质粒用FuGENE 6 脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418 筛选获得转染阳性的细胞系,检测转染细胞染色体数目及利用Annexin-V和TUNNEL 试剂盒检测细胞凋亡的变化.结果 A549细胞转入esp1基因后染色体异常分裂象减少,转染后细胞增殖减少,而去血清培养诱导的凋亡增加.结论 esp1的上调表达不仅对于肿瘤的异常染色体分裂象以及肿瘤细胞的异常增殖有一定的抑制作用,且对A549 细胞的凋亡有促进作用.
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电磁脉冲诱导肺癌细胞株A549凋亡的研究
目的研究电磁脉冲(EMP)对肺癌细胞A549凋亡的影响. 方法以场强为6×104 V/m的EMP辐照5次/2 min,然后采用细胞计数、MTT、流式细胞术及免疫组化染色的图像分析,观察EMP对肺癌细胞A549的损伤作用,所有数据经SPSS8.0软件进行分析. 结果 EMP可明显抑制肺癌细胞A549的增殖与活力.流式细胞术证明,A549细胞发生明显的凋亡.免疫组化的图像分析表明,伴有不同程度的Bcl-2蛋白表达的下调及P53蛋白表达的上调. 结论 EMP可诱导肺癌细胞A549的凋亡.Bcl-2及P53蛋白参与了A549细胞的凋亡过程.
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APE1表达变化对人非小细胞肺癌细胞 A549增殖的影响
目的：探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1，APE1）对人非小细胞肺癌细胞 A549增殖能力的影响，为肺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：使用脂质体转染法将重组表达质粒 pSIREN - RetroQ - APE1- shRNA 和 pOZN - HA - APE1导入 A549细胞，免疫印迹检测 APE1表达情况。MTT、平板克隆实验、免疫印迹检测 APE1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：重组载体 pSIREN - RetroQ - APE1- shRNA 转染细胞后，显著抑制 A549细胞中 APE1蛋白的表达，与对照组相比，增殖速率明显下降（P <0.05），平板克隆形成显著减少（P <0.05），并阻止细胞周期 G0/G1期向 S 期转化，降低 CDK2表达。而过表达 APE1可增加 A549细胞活力，促进细胞增殖，促进细胞周期G0/ G1期向 S 期转化。结论：APE1表达下调对非小细胞肺癌细胞 A549生长具有抑制作用，为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。
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靶向 siRNA 沉默 NF -κB/p65对肺腺癌细胞株 A549增殖与凋亡的影响
目的：研究运用 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制 NF -κB/ p65基因的表达对人肺腺癌细胞株 A5492细胞增殖、周期及凋亡的影响，探讨 NF -κB/ p65基因在肺腺癌发生发展中的作用。方法：利用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000将人 NF -κB/ p65的小干扰 RNA 转染入肺腺癌细胞株 A549中。运用 real time - PCR 和 Western blot 技术检测 A549细胞内 NF -κB/ p65、增殖相关基因 Cyclin D1和凋亡相关基因 Bcl-2、Bax 的 mRNA 的转录水平和蛋白的表达情况，MTT 法检测细胞的增殖活力，显微镜下观察细胞的生长情况。结果：NF -κB/ p65 siRNA 能有效地抑制 A549细胞中 NF -κB / p65基因在 mRNA 水平上的表达（P﹤0.001），同时下调 Cyclin D1和 Bcl -2的表达（均 P ﹤0.01）。上调 Bax 表达（P ﹤0.001）；蛋白表达也具同样趋势。MTT 实验证明 p65 siRNA 转染组中细胞增殖减慢；显微镜镜下观察显示，细胞生长减慢，凋亡形态改变明显。结论：体外实验初步证明 NF -κB/ p65基因在肺腺癌细胞株 A549增殖分化与凋亡方面扮演重要角色，通过沉默其表达可抑制肺腺癌细胞株 A549增殖并诱导其凋亡。进一步证实 NF -κB/ p65对 Cyclin D1、Bcl -2、Bax 具有调控作用，他们共同参与了肺腺癌的发生发展过程。
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β－arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的凋亡影响
目的：观察外源性β－arrestin2基因对人肺腺癌细胞株 A549凋亡的影响。方法：将真核表达重组体pcDNA3．1－β－arrestin2质粒和空载体 pcDNA3．1质粒采用脂质体转染技术分别导入人肺腺癌 A549细胞，然后采用 G418筛选方法获得稳定转染的细胞系，采用 qRT －PCR 和 Western blot 分别在基因水平和蛋白水平检测β－arrestin2基因的表达。采用流式细胞仪分析转染细胞的凋亡情况。结果：经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达β－arrestin2基因的 A549细胞系。转染β－arrestin2基因的细胞生长速度较未转染组和转染空白载体组相比明显减慢（P ＜0．05）。结论：β－arrestin2基因可促进人肺腺癌细胞 A549的细胞凋亡。
关键词： β-arrestin2 肺腺癌 A549 细胞 细胞凋亡 -
肺腺癌细胞 S100A6基因 siRNA 慢病毒载体构建及鉴定
目的：构建肺腺癌细胞 S100A6基因 siRNA 慢病毒载体并鉴定。方法：慢病毒载体（pLenR －GPH）构建靶向 S100A6基因的 RNA 干扰重组体，用以建立 S100A6基因稳定沉默的肺腺癌 A549细胞株。结果：PCR 鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入 pLenR －GPH 载体，测序结果证实三个重组慢病毒载体SH1、SH2、SH3的插入序列完全正确，重组慢病毒载体转染到293T 细胞中包装成病毒颗粒，将其感染肺癌A549细胞后，RT －PCR 和 Western blot 检测结果均证实三组重组体感染的细胞内 S100A6 mRNA 和蛋白的表达受到不同程度的抑制，沉默效率分别为98．29％、84．05％及78．24％。结论：成功构建了 S100A6基因 RNAi慢病毒重组载体，并建立了其稳定表达的肺腺癌 A549细胞株，为探讨 S100A6基因对肺腺癌生物学行为的影响提供了可靠的细胞模型。
