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siRNA 沉默 Chk1基因对二烯丙基二硫诱导胃癌细胞 SGC -7901凋亡敏感性的影响
目的：探讨 siRNA 沉默 Chk1基因表达对二烯丙基二硫诱导胃癌细胞 SGC -7901凋亡和细胞周期的影响。方法：采用 RNA 干扰技术在胃癌细胞 SGC -7901中将 Chk1基因沉默，Western blot 检测转染前后Chk1蛋白表达的变化，流式细胞术检测 Chk1基因沉默对二烯丙基二硫诱导胃癌细胞凋亡及细胞周期变化的影响。结果：转染 Chk1 siRNA 后，胃癌细胞 SGC -7901中 Chk1蛋白表达受抑制，明显低于对照组（ P ＜0.05）。FCM 检测结果显示：si - Chk1组较空白对照组 G2∕ M 期百分比有所降低（P ＜0.05），si - Chk1＋ DADS组 G2∕ M 期比例明显低于 Empty vector ＋ DADS 组（P ＜0.05）。siRNA 沉默 Chk1基因使二烯丙基二硫诱导的细胞凋亡率由（15.2±1.0）%上升到（30.9±1.9）%。结论：siRNA 沉默 Chk1基因可明显消除 G2∕ M 期阻滞，并显著增强二烯丙基二硫诱导胃癌细胞 SGC -7901凋亡的敏感性，提示 Chk1可作为二烯丙基二硫治疗胃癌的有效增敏靶点。
关键词： 细胞周期检测点激酶 1 RNA 干扰 二烯丙基二硫 细胞凋亡 -
siRNA 干扰 FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响
目的：探讨 FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达，并观察小干扰 RNA 沉默 FLOT2基因对肾细胞癌786- O 细胞增殖能力的影响。方法：将化学合成的 FLOT2的小干扰 siRNA 用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786- O 细胞；分别用 RT - PCR、Western blot 方法检测细胞转染前后 FLOT2以及细胞增殖相关因子 CCND1的表达。CCK -8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果：转染 FLOT2- siRNA 的肾细胞癌786-O 细胞，RT - PCR、Western blot 检测显示 FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P ＜0.05）；与对照组比较786-O 细胞增殖能力明显下降（P ＜0.05），细胞增殖相关因子 CCND1明显下调（P ＜0.05）。结论：FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达，采用特异性 FLOT2- siRNA 能够显著降低 FLOT2和 CCND1表达。干扰 FLOT2表达能显著抑制786- O 细胞的增殖，FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。
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一种基于人 miR -30结构高效干扰 LMP1基因表达的慢病毒载体的构建
目的：构建慢病毒载体并利用 miRNA 原理进行 LMP1病毒癌基因干扰的可行性及有效性研究。方法：基于人 miR -30a 结构，利用靶点分析软件设计4个 LMP1的候选干扰靶点，报告基因 EGFP 与 miR -LMP1靶点形成共顺反子表达，靶点载体质粒与 LMP1高表达质粒用脂质体共转染工具细胞293FT，用 West-ern blot 方法筛选有效的干扰靶点并用三质粒系统在293FT 细胞中包装慢病毒，进行滴度鉴定。结果：在293FT 工具细胞中成功筛选到一个高效干扰 LMP1基因的靶点序列，在 Western blot 水平的蛋白干扰率高达95%；在20ml 培养上清中可获得具有活性慢病毒颗粒7.2×108个，经纯化浓缩获得重组慢病毒颗粒，滴度高达6×109 TU/ ml，经流式细胞仪检测在80MOI 时其感染 EBV 阳性的鼻咽癌细胞株 C666-1的感染率高达80%以上。结论：基于人 miR -30a 结构的 miR - LMP1能高效干扰 LMP1基因的蛋白表达，利用慢病毒载体来建立稳定基因干扰肿瘤细胞株可能是一个良好的方法。
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靶向 CD44的 shRNA 片段逆转人胰腺癌细胞株 PANC －1侵袭表型机制
目的：利用 RNA 干扰技术沉默人胰腺癌细胞株 PANC －1中 CD44的表达，观察其对肿瘤侵袭性的抑制效果。方法：设计合成有效地干扰 CD44的 shRNA 序列。结果：通过平板克隆形成实验、软琼脂集落形成试验、Transwell 小室侵袭实验发现，胰腺癌细胞株转染干扰 CD44的 shRNA 序列后，其相关的增殖以及侵袭能力明显受抑制。Western Blot 发现随着 CD44的下调，AKT 被逐渐上调，而 p －ERK、p －AKT 却被逐渐下调。结论：靶向 CD44的 shRNA 技术可有效降低人胰腺癌细胞株 PANC －1的侵袭能力，可能的机制与影响其下游的 p －AKT、p －ERK 表达有关。针对 CD44的 RNA 干扰具有潜在的临床价值。
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肺腺癌细胞 S100A6基因 siRNA 慢病毒载体构建及鉴定
目的：构建肺腺癌细胞 S100A6基因 siRNA 慢病毒载体并鉴定。方法：慢病毒载体（pLenR －GPH）构建靶向 S100A6基因的 RNA 干扰重组体，用以建立 S100A6基因稳定沉默的肺腺癌 A549细胞株。结果：PCR 鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入 pLenR －GPH 载体，测序结果证实三个重组慢病毒载体SH1、SH2、SH3的插入序列完全正确，重组慢病毒载体转染到293T 细胞中包装成病毒颗粒，将其感染肺癌A549细胞后，RT －PCR 和 Western blot 检测结果均证实三组重组体感染的细胞内 S100A6 mRNA 和蛋白的表达受到不同程度的抑制，沉默效率分别为98．29％、84．05％及78．24％。结论：成功构建了 S100A6基因 RNAi慢病毒重组载体，并建立了其稳定表达的肺腺癌 A549细胞株，为探讨 S100A6基因对肺腺癌生物学行为的影响提供了可靠的细胞模型。
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CD24在复发性膀胱癌中的表达及其对癌细胞增殖的影响
目的：分析 CD24在复发性膀胱癌组织中的表达，探讨抑制 CD24表达对膀胱癌细胞增殖的影响。方法：应用免疫组化检测36例复发性膀胱癌组织中 CD24的表达情况，并进行半定量分析。利用脂质体转染法将含有 CD24特异性 siRNA 的真核表达质粒转染至人膀胱癌 BIU －87细胞中，实时定量 PCR 和 Western blot 法检测 BIU －87细胞中 CD24的表达情况改变，MTT 法、Transwells 侵袭实验分别检测下调 CD24的表达后，膀胱癌细胞增殖、侵袭能力发生的变化。并分析细胞中信号转导及转录活化因子（STAT3）、细胞周期蛋白（CyclinD1）、基质金属蛋白酶（MMP －9）的表达变化。结果：CD24在复发性膀胱癌组织中高表达，高级别膀胱癌组织中，阳性率达76．2％。细胞学实验中，经实时定量 PCR 和 Western blot 法证实实验组较对照组细胞CD24 mRNA 转录和蛋白表达水平明显降低。MTT 检测发现实验组较对照组细胞的增殖能力显著下降；Tran-swells 侵袭实验显示实验组的穿膜细胞数显著少于对照组。实验组中 STAT3、CyclinD1、MMP －9表达有明显下降。结论：CD24在复发性膀胱癌中高表达，并与肿瘤的分级呈正相关。体外实验中，抑制 CD24基因表达能显著抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力，间接提示 CD24可能参与膀胱癌的复发进程。
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shRNA 静默 CD4＋T 细胞 AHNAK1基因对小鼠甲状腺相关性眼病进程的抑制作用
目的：构建表达小鼠CD4＋T细胞钙支架蛋白AHNAK1的短发夹RNA（short hairpin RNA ，shRNA）慢病毒载体，并研究其对小鼠甲状腺相关性眼病（ thyroid-associated ophthalmopathy ，TAO）的抑制效应。
方法：设计并筛选对AHNAK1具有良好干扰效力的shRNA序列，慢病毒载体包装干扰序列，感染小鼠CD4＋T细胞，检测AHNAK1静默对T细胞功能的抑制作用，采用实验动物模型观察AHNAK1体内抑制甲状腺相关性眼病的效果。
结果：成功筛选出具有良好干扰效力的shRNA ，并包装入慢病毒。病毒滴度为1．0×106 TU/mL，转染慢病毒的CD4＋T细胞展现出失能倾向，抑制炎症免疫反应；在动物模型中抑制T细胞中AHNAK1表达可以有效控制甲状腺眼病的发生发展，显著降低治疗组T细胞中IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达。
结论：成功构建了表达小鼠AHNAK1 shRNA的慢病毒，具有抑制T细胞分泌IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达效应，能够有效抑制甲状腺眼病的发生发展。 -
糖尿病大鼠玻璃体腔注射缺氧诱导因子-1α siRNA对血管内皮生长因子蛋白表达的影响
目的：观察缺氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)小干扰RNA( siRNA)对糖尿病大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达的抑制作用,及其用于糖尿病新生血管性疾病治疗的可行性。
方法：以pSilencer2.1-U6 neo为质粒载体,构建HIF-1α. siRNA重组质粒。选取雄性Sprague-Dawley( SD)大鼠54只,随机分为正常对照组(15只)和实验组(39只)。实验组采用尾静脉注射链尿佐菌素( STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,造模成功后将实验组随机分为糖尿病组(15只)、基因治疗组(12只)和空载体组(12只)。正常对照组及糖尿病组大鼠均不做转染；基因治疗组和空载体组分别转染HIF-1α. siRNA 重组质粒和pSilencer空载体质粒。行苏木精-伊红染色( hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察视网膜组织形态,并采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。分别于干扰后24、48、72h,1wk时计算VEGF蛋白的抑制效率。采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。
结果：HIF-1α. siRNA 重组质粒经酶切、测序鉴定,确定为目的序列。 HE染色显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜不完整,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示：VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,主要位于神经节细胞层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义( P<0.05)。 VEGF蛋白抑制率24、48、72 h和1 wk时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。
结论：HIF-1α. siRNA重组质粒能够抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白的表达,可能成为一种治疗糖尿病性新生血管疾病的新方法。 -
RNA 结合蛋白 La 对宫颈癌细胞侵袭转移的影响及其机制
目的：探讨 RNA 结合蛋白 La(La)对宫颈癌细胞侵袭转移的作用及其作用机制。方法采用 RNA 干扰技术沉默 La 基因在宫颈癌细胞株 HeLa 中的表达，并通过 G418筛选，构建稳定表达的 HeLa 的 La 干扰克隆。采用划痕实验、Transwell 小室等检测 La 对宫颈癌细胞侵袭转移的影响。利用 Western blot 的方法检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达，并采用明胶酶谱的方法检测细胞培养上清中 MMP-2的活性。结果La 干扰后细胞的迁徙和侵袭能力明显降低，对细胞迁徙距离和穿过 Transwell 小室的细胞数目进行分析后发现，差异有统计学意义；同时发现在细胞中 MMP-2的蛋白表达水平及酶活性均降低，而 TIMP-2的蛋白表达水平上调。结论La 对宫颈癌的侵袭转移具有促进作用，这种作用可能与其对基质金属蛋白及其抑制剂的调控相关。
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携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定
目的：构建携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默 CIP2A 表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成 CIP2A shRNA,退火形成双链与 pDC316-EGFP-U6质粒 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA,以鉴定正确的 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA 克隆为模板 PCR 扩增 EGFP-CIP2A shRNA 片段,EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切 PCR 扩增产物及 pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA,建立载体细胞株 BHK/CIP2A-shRNA,采用 AAV MaxTM 包装系统大规模制备 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 并对其纯化及滴度测定。将 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 感染肝癌细胞 HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP 作对照,采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测 CIP2A shRNA 基因沉默效果。结果携带编码CIP2A shRNA 腺相关病毒载体质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA 经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确；将重组质粒与辅助病毒 HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞 BHK-21,成功制备重组腺相关病毒 rAAV2-CIP2A shRNA,经测定纯化所得 rAVV2病毒滴度为0.25×1012 v.g./mL。筛选 MOI 值为1×105感染肝癌细胞 HepG2,CIP2A mRNA 及蛋白表达水平分别于感染后24 h 和48 h 与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带 CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体 rAAV2-CIP2A shRNA。
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促红细胞生成素对缺氧复氧心肌细胞 caspase-3表达及Omi/HtrA2转位变化和 Omi/HtrA2沉默时对其的影响
目的：观察促红细胞生成素(EPO)及/或进一步沉默 Omi/HtrA2表达时对缺氧复氧(H/R)心肌细胞的影响,探索相关抗细胞凋亡机制。方法培养乳鼠心肌细胞株(H9C2细胞),分组(对照组、H/R 组及各浓度的 EPO 干预组)处理后,酶标仪检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)释放率,Western blot 检测细胞内 cleaved caspase-3、Omi/HtrA2蛋白表达变化；并观察 Omi/HtrA2在胞质和线粒体的表达变化(转位情况)。再经脂质体法将 Omi/HtrA2特异性 siRNA 干扰片段转染至 H9C2细胞中,RT-PCR 和 Western blot 验证 siRNA 对 Omi/HtrA2表达的沉默效应后,分组同前干预,分别检测各组细胞 LDH 释放率及 cleaved caspase-3表达变化。结果与 H/R 组相比, EPO 干预组细胞上清液 LDH 释放减少,cleaved caspase-3表达减弱；H/R 组 Omi/HtrA2蛋白表达在胞质中表达较对照组增多(向胞质发生转位),而 EPO(20 IU/mL)组其胞质转位减少。经 siRNA 干扰后,与 H/R 组相比,LDH 释放降低,cleaved caspase-3表达减弱,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论EPO 可能通过减少 Omi/HtrA2蛋白的转位,抑制 caspases-3通路激活,而发挥细胞保护作用。
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抑制 P-糖蛋白表达逆转视网膜母细胞瘤多药耐药研究?
目的：探讨应用 RNA 干扰(RNAi)技术逆转视网膜母细胞瘤多药耐药的可行性。方法：将设计合成的针对多药耐药基因 MDR1的特异性小分子干扰 RNA(siRNA),用脂质体转染具有 MDR1基因高表达的视网膜母细胞瘤耐药细胞株 SO-Rb50/VCR。用实时定量 RT-PCR 技术和 Westernblot 分别测定转染前后细胞 MDR1 mRNA 及 P-糖蛋白(P-gp)表达的变化；用 CCK-8法和 TUNEL 法检测转染前细胞株(VCR 组),转染后细胞(VCR+siRNA 组)对不同浓度长春新碱、依托泊苷和卡铂药物敏感性。结果：VCR+siRNA 组较 VCR 组比较,MDR1基因在 mRNA 水平和蛋白水平表达显著下降,差异具有统计学意义。随着长春新碱、依托泊苷浓度的升高 VCR+siR-NA 组较 VCR 组比较,细胞存活率显著降低,差异具有统计学意义。不同浓度的卡铂作用于 VCR组、CT 组和 VCR+siRNA 组细胞存活率、细胞凋亡率各组见未见显著性差异。随着长春新碱、依托泊苷浓度的升高,VCR+siRNA 组较 VCR 组比较,细胞凋亡率显著性升高,差异具有统计学意义。结论：在 SO-Rb50/VCR 细胞中,针对 MDR1合成的 siRNA 能够有效地抑制 MDR1 mRNA 和P-gp 的表达,并能恢复肿瘤细胞对长春新碱和依托泊苷的敏感性。应用 RNAi 技术,能够逆转 P-gp 引起的视网膜母细胞瘤多药耐药性。
关键词： RNA 干扰 视网膜母细胞瘤 多药耐药相关蛋白质类 P-糖蛋白 药物耐受性 -
Nrf2蛋白在维吾尔族妇女宫颈鳞癌中的表达及意义
目的：探究 Nrf2蛋白在维吾尔族宫颈鳞癌组织中的表达以及对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。方法运用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）和正常宫颈组织中Nrf2与 Keap1蛋白的表达。在细胞水平，运用基因沉默技术下调 SiHa 细胞中 NFE2L2基因的表达，并通过 qRT-PCR 和蛋白印迹法检测 NFE2L2 mRNA 和蛋白水平相应变化；Transwell 小室实验及流式细胞术等技术检测转染NFE2L2-siRNA 后 SiHa 细胞迁移、侵袭、凋亡及细胞周期的改变。结果免疫组化结果显示维吾尔族宫颈鳞癌组织中 Nrf2蛋白的阳性表达率（66．3％）明显高于 CIN 组织（56．5％）和正常宫颈组织（27．3％）（P ＜0．001）；转染NFE2L2-siRNA 下调宫颈癌 SiHa 细胞中 NFE2L2基因的表达后，NFE2L2 mRNA 水平和蛋白水平表达下降，同时 SiHa 细胞的迁移的细胞数目（103．00±37．58／125．33±34．67）和侵袭数目（82．25±23．56／54．75±9．07）较空白对照组和阴性对照组明显减少（P ＜0．01），细胞周期阻滞在 G0／G1期，SiHa 细胞凋亡率显著增加（P ＜0．01）。结论维吾尔族宫颈鳞癌组织中存在 Keap1-Nrf2通路的激活，NFE2L2基因沉默可明显抑制宫颈癌 SiHa 细胞的增殖、迁移及侵袭能力，并促进细胞凋亡。
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miRNA 146a 对软骨细胞 MMP 13表达的影响
目的：研究在正常软骨细胞及中期和晚期骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨细胞中上调或下调 miRNA 146a后基质金属蛋白酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP 13）的表达变化规律。探索 miRNA 146a 在骨关节炎发生、发展中的作用。方法收集正常人膝关节软骨4例，骨关节炎患者膝关节软骨12例。骨关节炎组又依据 Kellgren-Law-rence 的放射学诊断标准分为中期和晚期骨关节炎。通过化学转染的方法转染 miRNA 146a mimic 或 miRNA 146a in-hibitor 于各组软骨细胞，测定上调或下调 miRNA 146a 后，MMP 13蛋白水平表达的变化。结果正常人软骨细胞中上调 miRNA 146a 后，MMP 13的蛋白水平较对照组及抑制组均出现明显的上升，结果具有统计学意义；下调 miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平下降，结果没有统计学意义。中期 OA 软骨细胞表达 MMP 13水平高于晚期 OA 软骨细胞，差异具有统计学意义。中期 OA 软骨细胞上调 miRNA 146a 后，MMP 13的蛋白水平上升，结果具有统计学意义；抑制 miR-NA 146a 后，MMP 13的蛋白水平下降，结果具有统计学意义。晚期 OA 软骨细胞上调 miRNA 146a 后，MMP 13的蛋白水平上升，结果具有统计学意义；晚期 OA 软骨细胞抑制 miRNA 146a 后，MMP 13的蛋白水平下降，结果具有统计学意义。结论 miRNA 146a 可调控软骨细胞 MMP 13表达，从而参与骨关节炎的发生、发展。
关键词： 骨关节炎 miRNA 146a MMP 13 RNA 干扰 -
有效bcl-2 siRNA对HL-60细胞生长的抑制作用
目的 应用RNA干扰(RNAi)技术观察有效bcl-2 siRNA对白血病细胞HL-60凋亡的影响.方法 将有效bcl-2 siRNA 转染人HL-60细胞;用MTT法、流式细胞术(FCM)及Hoechst 33258荧光染色法观察细胞增生及凋亡情况.结果 有效bel-2 siRNA有抑制HL-60细胞生长及促进细胞凋亡的作用.结论 有效bcl-2 siRNA 能特异性促进HL-60细胞凋亡,抑制其生长.
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Twist 通过 PI3K／AKT 信号通路影响宫颈癌对紫杉醇的耐药性
目的：应用 RNA 干扰（RNAi）技术，沉默 Twist 基因，观察宫颈癌耐紫杉醇细胞中 PI3K 和 AKT 表达的存在的改变情况，对 Twist 基因在宫颈癌耐药过程中表现出来的作用机制进行探索。方法：（1）应用 pRNAT －U6．1／Neo 来进行四对含高效的靶向构建，进而实现对 Twist 基因载体 SL36－1、SL36－2、SL36－3、SL36－4质粒进行重组，并对重组载体进行酶切鉴定和测序。（2）用 Lipo2000脂质体将 pRNAT －U6．1／Neo －Twist shRNA 质粒转染人宫颈癌 caski 细胞，转染后24h 收集细胞用荧光显微镜观察转染情况。（3）在空白对照组、shRNA 质粒转染组、阴性对照组细胞中加入紫杉醇（1000nmol ／L），Westernblot 技术检测经紫杉醇处理后的转染 shRNA 质粒转染组、正常对照组、阴性对照组和空白对照细胞中 PI3K 和 AKT 的蛋白表达，分析 pRNAT －U6．1／Neo －Twist shRNA 质粒转染对于人宫颈癌 caski 细胞中 PI3CA 和 AKT 的蛋白表达的影响。结果：（1）应用显微镜可在转染成功的宫颈癌细胞中可见明显绿色荧光（GFP），转染 Twist shRNA 质粒24h 的宫颈癌细胞的转染效率为80％以上，之后应用 shRNA2质粒进行后续实验。（2）用 Westernblot 方法检测经紫杉醇处理后转染 Twist shRNA2质粒组中 PI3K 的蛋白表达较阴性对照组、正常对照组和空白对照组明显降低（P 均＜0．05），AKT 的蛋白表达较阴性对照组、正常对照组和空白对照组（P ＜0．05），而正常对照组和阴性对照组中 PI3K 和 AKT 的表达无明显差异（P 均＞0．05）。结论：（1）Twist 表达下调和 PI3K、AKT 表达下调可促进宫颈癌对紫杉醇的耐药性。（2）Twist 可通过 PI3K／AKT 信号通路调节宫颈癌对紫杉醇的耐药性。
