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N-Ras基因表达沉默与二羟环氧苯并芘转化的人支气管上皮细胞生长的关系
目的 构建N-Rus基因小发卡结构RNA(shRNA)干扰真核表达质粒载体,并初步观察其对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)生长的影响.方法 根据GenBank提供的N-Ras cDNA序列,设计并合成shRNA寡核苷酸片段,与含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建4个真核表达载体,并经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定.转染16HBE-T细胞48 h后,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测重组质粒对N-Bus基因表达的影响;用噻唑蓝法(MTT)观察重组质粒对细胞生长的抑制作用.结果 构建了4个N-Ras shRNA真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致.构建的4个表达载体pGPU6/GFP/Neo-NBas-566、pGPU6/GFP/Neo-NRas-305、pGPU6/GFP/Neo-NRas-613和pGPU6/GFP/Neo-NRus-791分别转染16HBE-T细胞48 h后,RT-PCR显示N-Ras基因mRNA表达水平依次下调95%、70%、92%和60%;Western blot显示蛋白表达依次降低92%、45%、58%和34%.MTT发现16HBE-T细胞的生长受到明显抑制,且与N-Ras基因表达水平正相关.结论 成功构建了N-Ras基因特异性shRNA真核细胞表达载体,有效沉默了N-Rus在16HBE-T细胞中的表达,抑制了恶性转化细胞的生长.
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人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定
目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果.方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定.确认质粒构建成功后,用脂质体(LipofectamineTM2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果.结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致；实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59％.结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础.
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小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究
目的 构建靶向乙型肝炎病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础.方法 设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72 h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量.结果 经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3.1-shHBX与设计一致.该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47.1%,使HBx蛋白表达量降低58.9%,而阴性对照质粒无此作用.结论 成功构建靶向HBX shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达.
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小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Flt-1基因表达的抑制作用
本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长因子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制.采用脂质体介导的方法将构建的人fit-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用G418抗性筛选获得阳性克隆:抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT-PCR和免疫印迹反应检测flt-1 mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT-PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达.结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt-1基因和蛋白在细胞中的表达,两组阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46.1%和65.4%;flt-1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力(4.3±1.2)%较对照组(12.7±1.9)%及(9.6±1.7)%明显降低(p＜0.01).结论:VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转柒入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平下降.这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移.
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携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达
目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA,并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对pkv2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGcsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒:采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列:脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误:绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功:RT-PCR和Western blot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA细胞t'Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质pGCsi-Pyk2 shRNA.并证明他能降4Pyk2在Lovo胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.
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小发夹RNA特异性抑制Hela细胞中hTERT基因的表达
目的:双链RNA特异性地干扰相应序列的mRNA的功能,是介导转录后基因沉默的重要因素.本研究旨在探讨能靶向作用于人端粒酶催化亚单位(humar telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA的小发夹双链RNA是否能抑制人宫颈癌细胞(Hela)中hTERT蛋白的表达.方法:构建能特异性作用于hTERT mRNA的小发夹RNA质粒表达载体.用免疫荧光法检测转染入Hela细胞的上述质粒对hTERT蛋白表达的影响.结果:转染特异性小发夹双链RNA质粒表达载体(p U6-TERT和pH1-TERT)的Hela细胞中其表达hTERT蛋白的阳性细胞数量明显减少;而转染非相关性小发夹双链RNA质粒表达载体p U6-bc12的Hela细胞并不影响其hTERT蛋白的表达.结论:该研究构建的靶向作用于hTERT的小发夹双链RNA质粒载体能使Hela细胞中hTERT mRNA的表达水平下调,并且这种下调作用能保持较长的时间.
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N-Ras基因靶向的shRNA抑制二羟环氧苯并芘诱导的恶变细胞增殖
目的 用小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默N-Ras基因表达,探讨N-Ras基因表达对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)恶性性状的影响.方法 将已建立的针对N-Ras基因的shRNA干扰表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566转染16HBE-T细胞,经G418筛选,建立稳定沉默N-Ras基因转化细胞系.采用Western blot筛选佳N-Ras基因沉默细胞系,用流式检测N-Ras沉默细胞周期变化,用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析.结果 成功培养出稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系,Western blot显示N-Ras蛋白抑制率高达86%.流式分析发现稳定沉默N-Ras基因表达诱导转化细胞G0/G1期捕获,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现稳定沉默N-Ras基因降低了体外恶性转化细胞的集落形成率、抑制了体内肿瘤细胞生长.结论 N-Ras基因沉默可以降低转化细胞的细胞周期进程和细胞恶性性状表型,提示N-Ras基因在二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变过程中具有重要作用.
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促甲状腺素通过促进TNF-α分泌下调3T3-L1脂肪细胞的IRS-1表达
转染促甲状腺素受体(TSHR) shRNA的3T3-L1脂肪细胞以牛促甲状腺素(TSH)刺激,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养基中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,Western印迹法检测胰岛素受体底物1(IRS-1)的蛋白表达,免疫沉淀法检测IRS-1酪氨酸磷酸化.结果显示,1 mIU/ml TSH明显增加3T3-L1脂肪细胞TNF-α分泌[(341.85±12.00对522.67±36.22)ng/L,P＜0.01];随着TSH刺激浓度的增加,IRS-1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化明显降低(均P＜0.01),而以RNA干扰下调TSHR后上述作用消失.另外,TNF-α拮抗剂WP9QY也可逆转TSH对IRS-1的下调作用.这些结果提示TSH与3T3-L1脂肪细胞表面TSHR结合后,可能通过促进TNF-α分泌进而下调IRS-1的表达及其酪氨酸磷酸化,而参与胰岛素抵抗的发生.
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Bcl-XL小发夹RNA腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用
目的:构建表达Bcl-XL小发夹RNA的腺病毒载体(Ad/Bcl-XL shRNA)并探讨其抗肿瘤作用.方法:构建、纯化重组腺病毒Ad/Bcl-XL shRNA.通过Western blotting、MTT分析验证它对Bcl-XL的下调及其杀伤肿瘤细胞的作用,并检测其处理后细胞凋亡信号的活化情况；在裸鼠皮下荷瘤模型中验证其体内抗肿瘤作用.结果:成功构建和纯化了Ad/Bcl-XL shRNA,它能显著下调结肠癌DLD1细胞Bcl-XL蛋白的表达；与Ad/GFP、PBS组相比,Ad/Bcl-XL shRNA组明显抑制人结肠癌细胞DLD1的生长[1000 MOI时(60.6±4.8)％vs(99.0±2.6)％、100％；2 000 MOI时,(37.3±6.9)％vs (99.0±2.1)％、100％,P＜0.01],但对正常人成纤维细胞无明显抑制作用(P＞0.05)；Ad/Bcl-XL shRNA组能有效诱导结肠癌细胞中凋亡信号casepase-9、casepase-3、PARP的活化.在裸鼠荷瘤模型中,与Ad/GFP、PBS组相比,Ad/Bcl-XL shRNA组显著抑制DLD1来源皮下肿瘤的生长[第29天时,(250.1±185.7) vs(880.0±286.1)、(911.0 ±389.1) mm3;P ＜0.01].结论:Ad/Bcl-XL shRNA能显著抑制结肠癌细胞在体内外的生长,其在结肠癌治疗中具有潜在的应用价值.
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大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况.方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中.在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscort~(TM)Ⅲ转染试剂将上述两种质粒分别转染人培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功.Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达.且IRF-1 shRNA-2具有佳沉默效率.结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料.
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大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6shRNA表达质粒的构建及鉴定
目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA (shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况.方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil- 1/GFP真核表达质粒中.在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选有效的TRAF6shRNA.结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功.Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有佳的沉默效率.结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础.
关键词： 肿瘤坏死因子受体相关因子6 小发夹RNA 肾小球系膜细胞 -
shRNA和siRNA敲降NET-1对A431细胞生物学行为影响的比较
目的:比较小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)敲降皮肤鳞癌细胞株(A431)中NET-1基因的表达,及其对癌细胞增殖、浸润的影响.方法:分别构建针对人NET-1基因的siRNA NET-1真核表达载体(pU6H1-GFP-siRNA NET-1,siRNA NET-1)和shRNA真核细胞表达质粒(psilencer4.1-shRNA NET-1,shRNA NET-1),同时构建相应载体的随机序列(target-off)的对照质粒(shRNA target-off和siRNA target-off).体外瞬时转染A431细胞,通过实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、Western Blot分别检测癌细胞内NET-1 mRNA和蛋白的表达,免疫荧光染色在镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法和流式细胞术检测细胞增殖;划痕试验和Transwell试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力,比较siRNA和shRNA对NET-1基因的抑制效果.结果:测序证实编码NET-1序列的siRNA和shRNA已经分别插入载体pU6H1-GFP和psilencer4.1的启动子之间,测序结果符合设计要求.转染siRNA NET-1和shRNA NET-1后,均能显著下调A431细胞NET-1 mRNA和蛋白的表达水平,显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润,与对照组(target-off)比较差异均有统计学意义(均P<0.005).在细胞生长曲线分析中显示转染shRNA NET-1组在72 h后抑制细胞增殖的效果强于siRNA NET-1组.结论:NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关.靶向NET-1的siRNA和shRNA真核表达载体均能特异、有效地下调NET-1基因的功能.shRNA介导的RNAi作用能更长期、稳定的抑制目的基因的表达,更适合于对目的基因功能进行长期研究.
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Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定
目的:构建Smad4基因小发夹RNA(shRNA)表达载体.方法:设计、合成3对编码Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列,并分别将其克隆入pGCsi-H1/Neo/GFP质粒,酶切、测序鉴定,脂质体法转染293细胞.实时荧光定量PCR检测RNA干扰(RNAi)的抑制效果.结果:在经HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切分别鉴定三种重组载体后,DNA测序证实小干扰RNA(siRNA)序列正确,并被准确克隆入载体.实时荧光定量PCR检测结果表明三种重组载体psiSmad4-1、psiSmad4-2和psiSmad4-3载体,分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39.00%、8.80%和73.80%.结论:成功构建Smad4 pGCsi-H1/Neo/GFP/shRNA质粒,为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础.
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Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响
[目的]利用RNA干扰(RNAi)技术观测其对白血病K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western blot分析检测转染前后cvclin D1蛋白表达变化;集落形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况.[结果]构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin D1基因表达;抑制K562细胞增殖,影响其集落形成能力;细胞阻滞于G0/G1期,细胞凋亡明显.而m-pshRNA-790质粒并无上述生物学效应.[结论]cyclin D1基因表达下调可抑制K562细胞生长,影响细胞周期分布,并诱导细胞凋亡.提示cyclin D1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点.
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靶向EBV潜伏期基因EBNA2小干涉RNA系统的构建
[目的]构建携带靶向EBV核抗原EBNA2(EBV nuclear antigen,EBNA)的pSUPER.retro RNAi逆转录病毒载体,进而筛选出稳定产毒的细胞克隆.[方法]用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列定向插入逆转录病毒载体pSUPER.retro,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系Pheonix A,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆.[结果]重组逆转病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7167bp和281bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染的包装细胞经G418筛选获得能产生逆转录病毒的抗性细胞克隆,病毒滴度为2.5×104 CFU/ml.[结论]成功构建和筛选出靶向EBV潜伏期基因EBNA2的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为深入探讨EBNA2基因的细胞转化和抗凋亡作用提供了实验基础.
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SHARP-2特异的RNA干扰腺病毒载体的构建及功能鉴定
目的 构建转录SHARP-2 基因特异性的小发夹RNA(SHARP-2-shRNA)的重组腺病毒(Rad-hSHARP),并观察其对正常大鼠肾细胞(NRK cell)SHARP-2基因的表达影响.方法 设计带有SHAPR-2特异性干扰序列的PDC316-SHARP-shRNA穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre 共转染293 细胞,并在293 细胞内进行同源重组,构建Rad-hSHARP.并使用实时定量RT-PCR在NRK细胞中对重组腺病毒干扰效果进行鉴定.结果 成功构建了特异性SHARP-2基因RNA 干扰的腺病毒载体系统,并有效抑制NRK 细胞中SHARP-2 基因的表达.结论 成功构建SHARP-2-shRNA 的Rad-hSHARP,为利用特异性沉默SHARP-2基因的腺病毒载体抑制T细胞增殖活化研究奠定基础.
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稳定转染靶向bcl-2的shRNA对胃癌SGC-7901细胞株增殖影响
目的 探讨稳定转染靶向bcl-2的小发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响.方法 构建针对bcl-2的shRNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养.RT-PCR方法检测稳定转染后SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响.结果 稳定转染shRNA后,SGC-7901细胞的bcl-2 mRNA表达明显下降;细胞增殖能力及凋亡率无明显变化.结论 稳定转染shRNA能长效抑制SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据.
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靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测
目的 构建靶向大鼠G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,探讨GPR91受体对高糖诱导下血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)释放的调节作用.方法 设计合成4对针对大鼠GPR91(NM_001001518)的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链DNA,克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定重组体.将各慢病毒shRNA干扰载体和辅助包装载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测.将各慢病毒载体转染RGC-5细胞后,Western blot法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体.使用45 mmol· L-1的高糖刺激RGC-5细胞24 h,用ELISA法观察干扰GPR91后VEGF的表达情况.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91构建正确;包装病毒颗粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4组病毒浓缩液的滴度依次为1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU · mL-.将慢病毒颗粒感染RGC-5细胞后,Western blot检测显示NC组GPR91蛋白(0.60±0.08)空白组(0.62±0.07)的表达无明显差异(F =49.03,P＞0.05).而与空白组相比,4个慢病毒载体组(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表达,差异有统计学意义(F=49.03,P＜0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干扰效率高.ELISA结果显示空白组、高糖组、高糖+NC组、高糖+pGCSIL-GFP-shG-PR91-3组VEGF蛋白表达分别为(25.63±4.52) pg·mL-、(72.74±8.24) pg·mL-、(71.68±8.31)pg· mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干扰载体可显著降低高糖引起的VEGF分泌,差异有统计学意义(F=30.852,P＜0.01).结论 本实验成功构建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装.所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的VEGF表达,为进一步研究GPR91基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础.
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Yes相关蛋白在胃腺癌中的表达及其下调对胃癌细胞增殖和转移的影响
目的 检测Yes相关蛋白(YAP)在人胃腺癌、胃腺瘤及正常胃黏膜组织中的表达,探讨YAP对胃癌细胞增殖和转移的作用及其分子机制.方法 免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测YAP在78例人胃腺癌、39例人胃腺瘤及46例正常人胃黏膜组织的表达.利用建立慢病毒小发夹RNA(shRNA)靶向YAP基因的胃癌SGC-7901细胞株,Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的蛋白表达水平.噻唑蓝(MTT)比色法和Transwell试验检测YAP下调对胃癌细胞增殖和转移的影响.结果 YAP在69.23％的胃腺癌组织中高表达,与正常胃黏膜(0.33 ±0.15)和胃腺瘤(0.42 ±0.20)比较,YAP mRNA在胃腺癌(1.74±0.46)的表达水平明显增高(P＜0.001).体外实验显示,YAP下调减少PCNA和MMP-2蛋白的表达,并抑制胃癌细胞增殖活性和转移能力.结论 YAP在人胃腺癌组织中高表达,并且YAP下调抑制胃癌细胞的增殖和转移.
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shRNA腺病毒介导的JNK1RNAi抑制U87MG人胶质瘤细胞的增殖
目的 研究腺病毒介导的shRNA对U87MG人胶质瘤细胞JNK1基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖的影响.方法 设计合成针对JNK1基因以及无义对照的shRNA序列,通过腺病毒介导shRNA的表达来下调JNK1的表达；Q-PCR和Western blot验证病毒效果；用BrdU掺入的方法 来检测细胞的增殖情况.结果 限制性酶切及DNA测序结果 证实shRNA插入片段完全正确；Q-PCR和Western blot结果 表明JNK1的表达与对照组相比明显下降；BrdU掺入结果 表明Ad-shJNK1处理组细胞增殖显著降低.结论 重组的JNK1 shRNA腺病毒构建成功,JNK1的下调明显抑制了细胞的增殖,为深入研究JNK信号通路在神经肿瘤中的作用奠定基础.
关键词： c-Jun氨基末端激酶 RNA干扰 小发夹RNA 细胞增殖 神经肿瘤
