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重铬酸钾致N-ras基因DNA损伤作用研究
目的研究重铬酸钾对N-ras基因的DNA损伤作用,探讨其致癌作用分子机制.方法制备N-ras基因外显子1单链探针;重铬酸钾染毒细胞提取基因组DNA,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色.结果重铬酸钾染毒剂量100μmol/L可检测到DNA损伤片段杂交条带,其损伤片段长于完整的N-ras基因外显子1;更高剂量(1000μmol/L)未能检测出DNA损伤作用.结论重铬酸钾可能造成N-ras基因外显子1上游序列DNA损伤,且该损伤作用可能正是其致癌作用分子机制的关键所在.
关键词： N-ras基因 DNA损伤 重铬酸钾 依赖随机化末端连接物PCR -
目标序列二级结构对RNA干扰效果的影响
目的探讨RNA二级结构对RNA干扰效果的影响,为RNA干扰靶序列的选择及设计有效siRNA提供依据.方法以K562细胞为模型,N-RAS基因mRNA为模板,分别针对二级结构茎区及二级结构环区设计4对siRNA,并分别采用RT-PCR、细胞活力检测及流式细胞检测等方法在RNA及细胞水平检测干扰效果差异.结果干扰结果表明,针对目标序列的siRNA均能对同源基因的表达产生一定程度的抑制,而针对二级结构环区目标序列的siRNA干扰效果明显优于针对二级结构茎区的siRNA.结论RNA干扰效果与目标序列二级结构密切相关,在进行RNA干扰实验的目标序列选择时,应考虑二级结构的因素.
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RNA干扰肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因对放射敏感性的影响
目的 探讨RNA干扰(RNAi)N-Ras基因增强人肝癌MHCC-97细胞的放射敏感性.方法 通过构建干扰N-Ras基因siRNA,采用免疫组织化学法、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、MTT法观察RNAi前后肝癌MHCC97-H细胞RNA水平、蛋白水平、生长情况等变化,照射后用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化.结果 MHCC97-H细胞株RNAi后mRNA表达抑制率为96.9%±0.159%,RNAi前后差异有统计学意义(t=40.377,P＜0.05),蛋白表达抑制率为89.8%±0.012%,RNAi前后差异有统计学意义(t=31.595,P＜0.05),免疫组织化学显示90%表达被抑制,细胞生长抑制率为21.9%,RNAi前后差异均有统计学意义(F=4.63,P＜0.05).MHCC97.H细胞RNAi后增敏比(SER)=1.15.结论 RNAi肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因可以达到放射增敏的目的.
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SBPS对荷瘤小鼠癌基因表达的影响
目的:为探明半枝莲多糖对HepA瘤组织N-ras、c-myc基因表达的影响.方法:运用原位杂交法、SP免疫组化染色技术及多媒体彩色病理图文分析系统测定HepA瘤细胞中N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达量.结果:半枝莲多糖组、猪苓多糖组中N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达量均显著低于荷瘤组(P<0.01),半枝莲多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论:半枝莲多糖可通过降低N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达,而抑制HepA瘤细胞的增殖.
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二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响
目的 探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响.方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化.利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化.结果 RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍.免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者.结论 N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用.
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N-Ras基因靶向的shRNA抑制二羟环氧苯并芘诱导的恶变细胞增殖
目的 用小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默N-Ras基因表达,探讨N-Ras基因表达对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)恶性性状的影响.方法 将已建立的针对N-Ras基因的shRNA干扰表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566转染16HBE-T细胞,经G418筛选,建立稳定沉默N-Ras基因转化细胞系.采用Western blot筛选佳N-Ras基因沉默细胞系,用流式检测N-Ras沉默细胞周期变化,用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析.结果 成功培养出稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系,Western blot显示N-Ras蛋白抑制率高达86%.流式分析发现稳定沉默N-Ras基因表达诱导转化细胞G0/G1期捕获,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现稳定沉默N-Ras基因降低了体外恶性转化细胞的集落形成率、抑制了体内肿瘤细胞生长.结论 N-Ras基因沉默可以降低转化细胞的细胞周期进程和细胞恶性性状表型,提示N-Ras基因在二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变过程中具有重要作用.
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中药复方对急性髓细胞性白血病干细胞Flt3和N-ras基因表达的影响
背景:在白血病患者体内存在一群白血病干细胞,这些恶性干细胞是白血病细胞存在和不断增殖的根源,针对干预白血病干细胞的特异性靶向治疗药物已成为近年来研究热点.目的:探讨中药复方对急性髓细胞性白血病干细胞Flt3和N-ras基因表达的影响.设计、时间及地点:随机区组实验,于2007-09/2008-12在山东中医药大学附属医院完成.对象:2006-2007年山东中医药大学附属医院、山东大学齐鲁医院血液科就诊的急性髓细胞性白血病初治患者50例,FAB分型M15例,M215例,M49例,M521例.方法:原方:黄芪、白花蛇舌草、小蓟、太子参、半枝莲、蒲公英、生地、黄精、女贞子、旱莲草、天冬、麦冬、白术、茯苓、甘草.扶正方:黄芪、太子参、生地、黄精、女贞子、天冬、麦冬、白术、茯苓、甘草.祛邪方:白花蛇舌草、小蓟、半枝莲、蒲公英、旱莲草.制剂:上述3组组方药物由山东中医药大学附属医院中药制剂实验室(国家三级重要制剂实验室)配制成1 g/mL的药液,无菌试验阴性后过滤除菌备用.常规无菌采集急性髓细胞性白血病M1,M2,M4,M5型患者骨髓各5 mL,稀释后加入淋巴细胞分离液,联合应用免疫磁珠分选系统和流式细胞仪分离纯化白血病干细胞.调整细胞浓度至2×108L-1,均分成4组:对照组不加药物,实验组分别加入原方、扶正方、祛邪方的对应中药制剂,终浓度为100 mg/L,继续培养48 h后进行指标检测.主要观察指标:RT-PCR法检测Flt3、N-ras基因的表达.结果:与对照组比较,原方组、扶正方组、祛邪方组Flt3表达阳性率均明显降低(P<0.05),但原方组降低幅度明显大于扶正方组、祛邪方组(P<0.05);扶正方组与祛邪方组Flt3表达阳性率比较无明显差异(P>0.05).4组N-ras表达阳性率与Flt3表达情况基本一致.结论:Flt3和N-ras基因在白血病干细胞中存在过度表达,中药原方及其拆方后的扶正方、祛邪方均能够降低白血病干细胞中Flt3和N-ras基因的表达水平.
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树舌多糖GF对HepA瘤细胞N-ras基因表达的影响
目的:探明树舌多糖GF对HepA瘤组织N-ras基因表达的影响.方法:运用原位杂交法、SP免疫组化染色技术及多媒体彩色病理图文分析系统测定HepA瘤细包中N-ras mRNA量及N-Ras蛋白的表达量.结果:树舌多糖组、猪苓多糖组中N-ras mRNA量及Ras蛋白的表达量均显著低于荷瘤组(P＜0.01),树舌多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论:初步认为树舌多糖GF可通过降低N-rasmRNA量及Ras蛋白的表达,而抑制HepA瘤细胞的增殖.
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树舌多糖GF对HepA瘤细胞N-ras、C-myc蛋白表达的影响
目的:探明树舌多糖GF对HepA瘤组织N-ras、c-myc蛋白表达的影响.方法:运用SP免疫组化染色技术及多媒体彩色病理图文分析系统测定HepA瘤细胞中N-ras、C-myc蛋白的表达量.结果:树舌多糖组、猪苓多糖组中N-ras、C-mye蛋白的表达量均显著低于荷瘤组(P<0.01),树舌多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论:树舌多糖GF可通过降低N-ras、C-myc蛋白的表达,抑制He-pA瘤细胞的增殖.
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反义N-ras寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响
目的探讨N-ras反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对前列腺癌细胞增殖的影响.方法针对N-ras基因转录、翻译起始区分别合成硫代修饰的ASODN,采用3H-TdR掺入、流式细胞荧光免疫和斑点杂交法检测LNCaP细胞增殖和N-ras基因表达.结果两种ASODN单独作用后,LNCaP细胞内N-ras mRNA、p21蛋白和PSA表达水平以及3H-TdR掺入率明显低于对照组,10 μmol/L浓度对细胞生长的抑制率分别达63%,51%;二者联合应用后,N-ras基因表达、PSA水平以及3H-TdR掺入率进一步降低,细胞生长抑制率进一步增高达85%.结论 N-ras ASODN可有效抑制前列腺癌细胞增殖;同时证明N-ras在前列腺癌发生发展中起重要作用.
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突变N-ras基因重组痘苗病毒rV-N-ras/61的构建
目的：构建N-ras基因第61位密码子突变基因(N-ras／61)的重组痘苗病毒，通过痘苗病毒载体所产生的蛋白的强烈免疫原性来提高变异N-ras蛋白的肿瘤抗原性。方法：利用双PCR方法得到第61位突变的N-ras／61基因片段(500bp)，将该基因片段插入痘苗病毒表达载体P1108，通过Cell FECTIN转染CV-1细胞，以PCR，Western blot方法鉴定重组痘苗病毒。结果：通过tk-筛选、PCR鉴定，得了第61位突变N-ras／61基因的重组痘苗病毒rV-N-ras／61，Western blot检测其在CV-1细胞中有表达。结论：目前对突变ras基因的研究多着重于机理方面，本研究对研制有效的突变ras基因疫苗是一个有益的尝试，其免疫治疗作用有待于进一步研究。
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树舌多糖GF对HepA瘤细胞N-ras、C-myc基因表达的影响
目的 为探明树舌多糖GF对HepA瘤组织N-ras、C-myc基因表达的影响.方法 运用原位杂交法、SP免疫组化染色技术及多媒体彩色病理图文分析系统测定HepA瘤细胞中N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达量.结果 树舌多糖组、猪苓多糖组中N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达量均显著低于荷瘤组(P＜0.01),树舌多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论 树舌多糖GF可通过降低N-ras、C-myc mRNA及蛋白的表达,而抑制HepA瘤细胞的增殖.
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PCR-SSCP检测急性白血病患者N-ras基因突变及临床意义初探
目的探讨N-ras基因突变与急性白血病发生的关系.方法采取骨髓和外周血白细胞提取DNA,用PCR-SSCP分析技术分别对急性白血病患者、正常对照组的N-ras基因突变进行检测.结果84例急性白血病患者中25例发生N-ras基因突变,基因变异频率为29.8%,其中急性淋巴细胞白血病为18.6%,急性髓细胞白血病为41.4%;11例随访6个月,7例N-ras基因突变消失,4例N-ras基因突变持续存在;正常对照组未发现N-ras基因突变.结论N-ras基因突变对急性白血病患者的预后具有一定的参考价值.
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N-ras基因DNA损伤检测方法的建立
目的建立应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)技术检测N-ras基因DNA损伤的试验方法.方法采用单引物PCR技术制备N-ras基因外显子1单链探针,酶切构建DNA损伤模型,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色. 结果单引物PCR技术制备单链探针获得成功,目的基因在相应位置出现了清晰的杂交条带.结论 RDPCR技术可定位检测到该酶切DNA损伤位点,表明该方法已成功建立,将有利于其在化学致癌作用机制研究及肿瘤预防领域的应用.
关键词： N-ras基因 DNA损伤 依赖随机化末端连接物PCR
