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RDPCR检测DNA损伤定位于核苷酸水平的研究
目的 简化RDPCR建立程序,并在核酸序列水平精确定位DNA损伤. 方法 培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针.扩增k-ras基因外显子2(以下称短片段).酶切短片段和基因组DNA构建损伤模型,前者经依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)扩增,每一步产物作凝胶电泳,终产物与单链探针杂交显色,并进行测序;后者以短片段建立的实验条件进行RDPCR扩增,产物与单链探针杂交显色,并进行测序. 结果 凝胶电泳可见酶切短片段在RDPCR中每一步骤的目的 产物条带;酶切短片段和酶切基因组DNA的RDPCR产物均在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤均位于Hinfl在k-ras外显子2上的酶切位点. 结论 短片段建立RDPCR的实验条件简单易行;并首次利用RDPCR检测DNA损伤精确定位于核酸序列水平的碱基位置.
关键词： 依赖随机化末端连接物PCR DNA损伤 定位检测 核苷酸 -
重铬酸钾致N-ras基因DNA损伤作用研究
目的研究重铬酸钾对N-ras基因的DNA损伤作用,探讨其致癌作用分子机制.方法制备N-ras基因外显子1单链探针;重铬酸钾染毒细胞提取基因组DNA,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色.结果重铬酸钾染毒剂量100μmol/L可检测到DNA损伤片段杂交条带,其损伤片段长于完整的N-ras基因外显子1;更高剂量(1000μmol/L)未能检测出DNA损伤作用.结论重铬酸钾可能造成N-ras基因外显子1上游序列DNA损伤,且该损伤作用可能正是其致癌作用分子机制的关键所在.
关键词： N-ras基因 DNA损伤 重铬酸钾 依赖随机化末端连接物PCR -
联苯胺对k-ras基因DNA损伤位点研究
目的 在核酸序列水平定位检测联苯胺对k-ras基因的DNA损伤.方法 联苯胺染毒TK6细胞,提取基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针,应用依赖随机化末端连接物PCR进行Southern blot杂交,对产物进行测序分析.结果 联苯胺染毒剂量100 μmol/L检测到较k-ras外显子2短的一条清晰的杂交条带,测序结果表明linker与k-ras外显子2的第66位碱基T发生连接.结论 首次证实联苯胺可引起k-ras外显子2发生DNA损伤,该损伤位点位于k-ras外显子2的第65位碱基G,可能是联苯胺重要的致癌作用靶点.
关键词： 联苯胺 DNA损伤 损伤位点 K-ras基因 依赖随机化末端连接物PCR -
核酸序列水平定位DNA损伤的实验研究
目的 研究在核酸序列水平定位DNA损伤的方法.方法 培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针.酶切基因组DNA构建损伤模型,应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)进行Southern blot,对产物进行测序.结果 酶切DNA的RDPCR产物在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤位于HinfⅠ在k-ras外显子2的酶切位点.结论 将RDPCR和测序技术结合在一起,可在核酸水平上准确定位DNA损伤的碱基位置.
关键词： DNA损伤 定位检测 K-ras基因 依赖随机化末端连接物PCR -
N-ras基因DNA损伤检测方法的建立
目的建立应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)技术检测N-ras基因DNA损伤的试验方法.方法采用单引物PCR技术制备N-ras基因外显子1单链探针,酶切构建DNA损伤模型,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色. 结果单引物PCR技术制备单链探针获得成功,目的基因在相应位置出现了清晰的杂交条带.结论 RDPCR技术可定位检测到该酶切DNA损伤位点,表明该方法已成功建立,将有利于其在化学致癌作用机制研究及肿瘤预防领域的应用.
关键词： N-ras基因 DNA损伤 依赖随机化末端连接物PCR
