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干扰素调节因子1对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响
目的 研究干扰素调节因子1(IRF-1)对小鼠肝脏缺血再灌注(IR)损伤的影响及机制,寻求减轻肝脏缺血再灌注损伤的有效方法.方法 将小鼠分为对照组(假手术组)、小鼠肝脏热IR损伤模型组(IR组)和重组IRF-1干预组(IRF-1组),构建小鼠肝脏缺再灌注损伤模型.检测假手术组和IR组小鼠IRF-1的mRNA和蛋白水平、肝功能和肝组织病理变化;检测IR组和IRF-1组IR损伤6h后肝细胞IRF-1、p-Stat1、p-P38、PARP1与CaSpase-3蛋白水平的变化以及增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况.结果 小鼠肝脏缺血再灌注后,肝组织IRF-1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高,再灌注6h时达到峰值,与假手术组相比,差异有统计学意义(t再灌注2 h=-3.512、t再灌注6 h=-4.247、t再灌注12 h=-4.088、t再灌24h=-3.851;P ＜0.05);IR组小鼠血清ALT、AST水平(tALT=4.931、4.592、4.277、4.809;tAST =4.980、4.617、4.336、4.915;P ＜0.05)在各个时间点均高于假手术组,肝脏病理学改变亦比假手术组明显加重.使用重组IRF-1干预后,肝细胞中IRF-1、p-Stat1、p-P38、PARP1与Caspase-3蛋白水平均升高,PCNA表达减少.结论 IRF-1表达与肝脏缺血再灌注损伤密切相关,其机制可能与应激活化蛋白激酶(JNK MAPK)的激活及抑制PCNA表达有关.
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信号转导子和转录激活子-1、干扰素调节因子-1及干扰素-γ在支气管哮喘儿童中的表达及其临床意义
目的 在支气管哮喘儿童外周血单个核细胞中,检测信号转导子和转录激活子-1 (STAT1)、干扰素调节因子-1(IRF1)及干扰素-γ(IFN-γ)的表达,以进一步探讨其在哮喘病理生理机制中的作用.方法 选取2017年9月至2018 年5 月,我院儿科门诊就诊以及住院的急性发作期支气管哮喘患儿38例作为哮喘组,该38 例患儿经规范治疗后,哮喘良好控制患儿作为哮喘治疗有效组(n＝23),哮喘部分控制及未控制患儿作为哮喘治疗无效组(n＝15).选取同期健康儿童25例作为对照组.应用 RT-PCR 和 Western blot 方法 检测各组外周血单个核细胞中 STAT1、 IRF1 及 IFN-γ 的mRNA和蛋白表达,分析支气管哮喘儿童 STAT1、IRF1 及 IFN-γ 的 mRNA 和蛋白表达水平相关性.结果 哮喘组、哮喘治疗有效组、哮喘治疗无效组STAT1、IRF1 mRNA及蛋白表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05);哮喘治疗有效组IRF1 mRNA及蛋白表达均低于哮喘治疗无效组,差异均有统计学意义(P<0. 05);哮喘组、哮喘治疗有效组、哮喘治疗无效组INF-γ mRNA及蛋白表达均低于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05).结论 STAT1在支气管哮喘患儿中高表达,IFN-γ在支气管哮喘患儿中低表达. IRF1在支气管哮喘患儿中高表达,且其表达与治疗有效与否密切相关.
关键词： 支气管哮喘 信号转导子和转录激活子-1 干扰素调节因子-1 干扰素-γ 儿童 -
肿瘤抑制基因XAF1启动子序列中活性IRF-1作用元件的鉴定
目的 在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件.方法 通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30～-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1.应用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测IRFE-XAF1的核蛋白结合活性,并分别定点突变其核心序列内-34nt和序列旁-28nt,检测突变后XAF1启动子活性变化及对IFN-α作用的影响.结果 EMSA实验发现32P标记的含IRFE-XAF1的双链寡核苷酸DNA探针可与细胞核蛋白结合,且可被IRF-E同义探针阻断,定点突变后结合活性丧失,证实该IRFE-XAF1位点具有与转录因子结合的活性.含该IRFE-XAF1位点的XAF1启动子序列具有启动子活性且可被IFN-α诱导,IRFE-XAF1序列定点突变后启动子活性明显降低,其中-34nt突变后完全消除了IFN-α上调启动子活性的作用.结论 XAF1的转录起始序列具有一高度活性的IRF-E,其序列为-38nt GAAACGAAA-30nt,这一发现提示XAF1是IFN-α诱导肿瘤细胞分化的作用基因.
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干扰素调节因子-1和CD74的表达变化与自发性高血压大鼠源大血管平滑肌细胞增殖相关
目的:借助体外模型验证IRF-1、 CD74、 CD36、 GAP43、 CYP2E1和TCA4基因表达变化是否与糖尿病大血管病变相关. 方法:取自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并将其分别培养于含不同浓度葡萄糖(5.5、 15、 25、 30mmol/L和35mmol/L)、波动糖中(25mmol/L和5.5mmol/L葡萄糖交替,每一浓度持续12h)以及持续高糖(25mmol/L)中,48h后运用半定量RT-PCR检测IRF-1、 CD74、 CD36、 CYP2E1和TCA4的表达变化,SPSS分析基因变化与平滑肌增殖的相关性. 结果:葡萄糖浓度低于30mmol/L时,平滑肌细胞的增殖随糖浓度的增加而加速.持续高糖中培养平滑肌细胞自第6h起增殖明显.统计分析显示,CD74、 IRF-1和GAP43的表达变化与平滑肌细胞的增殖存在相关性. 结论:IRF-1和CD74参与调节糖尿病大血管病变中平滑肌细胞的增殖.
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干扰素调节因子-1与缺血性脑损伤
干扰素调节因子-1(IRF-1)参与炎症、细胞周期和细胞凋亡等的分子机制.研究表明,缺血性脑损伤后期IRF-1的表达明显增加,表明其是在基因水平参与缺血性脑损伤正反馈机制的因子,是联系脑缺血早期和晚期损伤的重要因子之一.因此,IRF-1成为在脑缺血治疗中阻断级联反应的靶点之一.
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SLE干扰素调节因子-1基因表达及泌乳素的研究
目的 探讨SLE患者中干扰素调节因子-1(IRF-1)基因的表达情况及泌乳素(PRL)对其干预作用.方法 电化学发光仪检测30例SLE患者与20例正常人对照组在清晨静息状态下的血清PRL水平,按密度梯度离心法分离、培养外周血PBMC,将样本分为SLE患者组、正常人对照组、正常PRL的SLE患者组+重组人泌乳素(rhPRL)和正常人对照组+rhPRL等4组.应用RT-PeR结合凝胶图象扫描技术检测IRF-1基因的表达情况.结果 SLE患者组与正常人对照组IRF-1基因表达的相对值分别为0.89±0.21和0.78±0.18,两组比较,差异有统计学意义(P=0.026),高PRL的SLE患者组为1.06±0.26,显著高于正常PRL的SLE患者组的0.82±0.21(P=0.005),而正常PRL的SLE患者组与正常人对照组间差异无统计学意义(P=0.514).经rhPRL刺激后,正常PRL的SLE患者IRF-1基因表达的相对值为0.99±0.22,显著高于rhPRL刺激前(P=0.036),而正常人对照组在刺激前后差异无统计学意义.结论 SLE中存在IRF-1基因的表达异常,高PRL水平可能是导致IRF-1基因异常表达的原因之一.
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大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况.方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中.在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscort~(TM)Ⅲ转染试剂将上述两种质粒分别转染人培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功.Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达.且IRF-1 shRNA-2具有佳沉默效率.结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料.
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pErk1/2在干扰素-γ对干扰素调节因子-1沉默后表达Akt的32D细胞生长中的作用
目的：运用siRNA沉默干扰素调节因子-1（IRF-1）基因，观察干扰素-γ（IFN-γ）对IRF-1沉默后表达Akt的32D细胞生长增殖的作用，探讨IFN-γ由抑制造血逆转为促进造血的机制。方法：培养表达野生型Akt与无活性型Akt的32D细胞并分别转染，针对IRF-1-siRNA质粒以沉默IRF-1基因，用实时定量聚合酶链反应检测沉默效果，Western-blotting检测IRF-1蛋白表达以验证沉默效果。将处于对数生长期的两株细胞分成3大组：siRNA干扰组、空质粒阴性对照组及空白对照组，前两组分别加入不同浓度的IFN-γ共孵育，用MTS法检测两株细胞增殖情况。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；用Western-blotting检测p-Erk1/2表达。结果：（1）加IFN-γ24h后，IRF-1沉默组在IFN-γ低浓度时促进增殖，抑制凋亡。高浓度的IFN-γ仍抑制增殖，促进凋亡。在48h以后IRF-1沉默组各浓度的IFN-γ都促进增殖，抑制凋亡（P＜0.05）。（2）表达野生型Akt的32D细胞在各时间点的增殖比例都大于表达无活性型Akt的细胞。且凋亡率都小于表达无活性型Akt的各组细胞，两者在48h比较差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）表达无活性型Akt的32D细胞，加入IFN-γ后各组均上调了pErk1/2的表达（P＜0.05）。但IRF-1沉默前后，各组pErk1/2表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。表达野生型Akt的32D细胞，在IRF-1沉默后各浓度IFN-γ均下调pErk1/2的表达（P＜0.05）。结论：（1）IRF-1在IFN-γ的促凋亡作用中起重要作用。（2）有活性Akt的表达可抑制Erk信号通路，其活性状态决定了IRF-1封闭后IFN-γ对pErk1/2表达的作用，pErk1/2的表达影响细胞增殖与凋亡，但并不决定IFN-γ作用的逆转。（3）Akt信号通路在IFN-γ逆转机制中起作用。
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干扰素调节因子-1调控P38 MAPK信号通路参与小鼠肝缺血再灌注损伤
目的 探讨干扰素调节因子-1 (IRF-1)调控P38 MAPK信号通路对小鼠肝缺血再灌注损伤(IRI)的影响及其机制.方法 采用随机数字表法将C57BL/6小鼠分为4组,每组10只,建立小鼠肝IRI模型.(1)Ad-GFP组:在建立肝IRI模型前(术前)6h经小鼠尾静脉注射GFP对照病毒液40μl;(2) Ad-IRF-1组:于术前6h注射高表达IRF1的病毒液40 μl;(3)Ad-IRF-1+ SB203580组(实验组):于术前6h注射高表达IRF-1的病毒液40μl,同时经腹腔注射SB203580 2 mg/kg;(4)对照组:于术前6h注射等体积生理盐水.检测各组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的变化,HE染色观察肝组织病理学改变,TUNEL法检测肝细胞凋亡情况,免疫组织化学染色法检测肝组织PCNA的表达情况.用AML 12细胞建立模拟IRI模型.将细胞分为对照组、GFP-NC组、GFP-IRF-1组、siRNA-NC组和IRF-1 siRNA组.采用蛋白质印迹法检测IRF-1、P38、p-P38、Caspase-3蛋白的表达.结果 与Ad-GFP组相比,Ad-IRF-1组小鼠血清ALT和AST升高(P＜0.05);病理学检查见肝细胞肿胀,肝窦狭窄,片状坏死及红细胞淤积,肝组织结构破坏严重;肝细胞凋亡率增高(P＜0.05);PCNA呈弱表达或不表达.实验组较Ad-IRF-1组肝损伤减轻,肝细胞凋亡减少(P＜0.05),PCNA表达增多.此外,GFP-IRF-1组AML12细胞的IRF-1、p-P38、Caspase-3蛋白表达水平明显高于GFP-NC组(P＜0.05);IRF-1 siRNA组的IRF-1、p-P38、Caspase-3蛋白表达水平明显低于siRNA-NC组(P＜0.05).结论 IRF-1的表达增加加重了小鼠肝脏的IRI,其机制可能与IRF-1激活P38 MAPK通路,进而加重肝细胞凋亡有关.抑制IRF-1表达或P38活性能够减轻小鼠肝脏的IRI.
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干扰素调节因子1调控线粒体自噬参与小鼠肝缺血再灌注损伤
目的 探讨干扰素调节因子-1(IRF-1)调控线粒体自噬对小鼠肝缺血再灌注损伤的影响.方法 选择健康雄性C57BL/6小鼠建立活体小鼠肝缺血再灌注损伤模型,用随机数字表法分为假手术组(sham)和缺血再灌注组(IR),每组6只.血生化检测两组小鼠血清ALT、AST变化,罗丹明123染色(Rhodamine 123)法检测肝细胞线粒体损伤情况,HE染色观察肝组织病理学改变,TUNEL法检测肝细胞凋亡情况.Western blot检测IRF-1、Nix、LC3和Caspase-3蛋白表达.AML12细胞系建立离体肝细胞缺血再灌注损伤模型,分为siRNA-NC组和siIRF-1组.PI染色法检测AML12细胞凋亡情况,免疫荧光观察AML12细胞内自噬体形成情况,Western blot检测IRF-1、Nix、LC3和Bax蛋白表达.结果 与假手术组比较,缺血再灌注组小鼠血清ALT、AST明显升高(P＜0.0001);罗丹明123染色法见缺血再灌注组线粒体膜电位明显下降,线粒体损伤严重;病理学检查见缺血再灌注组肝细胞肿胀、脂肪变性,肝窦狭窄,中性粒细胞浸润和片状坏死,肝组织结构破坏严重;TUNEL法检测见IR组肝细胞凋亡率明显增高(P＜0.0001);Western blot检测显示,缺血再灌注组IRF-1、Caspase-3蛋白表达水平明显高于假手术组,Nix、LC3Ⅱ表达水平明显低于假手术组.PI染色法示,SiRNA-NC组细胞凋亡率明显高于siIRF-1组(P＜O.0001).免疫荧光示SiRNA-NC组细胞内自噬体个数明显低于siIRF-1组(P＜0.0001);Western blot检测显示SiRNA-NC组IRF-1、Bax蛋白表达水平明显高于siIRF-1组,Nix、LC3Ⅱ表达水平明显低于siIRF-1组.结论 IRF-1加重小鼠肝缺血再灌注损伤,其机制可能与IRF-1抑制线粒体自噬,促进肝细胞凋亡有关.抑制IRF-1表达能够提高线粒体自噬,对肝缺血再灌注起到保护作用.
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神经生长因子通过诱导IRF-1核内转运增强PC-12细胞钠电流的表达
目的:初步探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对类感觉神经元细胞株大鼠嗜铬细胞(rat pheochromocytoma cell,PC-12)中的Na+电流变化的影响.方法:用不同浓度的NGF(0～200 ng/mL)刺激PC-12细胞,采用Real-time PCR检测IRF-1 mRNA表达变化,Western印迹检测IRF-1的活化.然后用全细胞膜片钳技术观察IRF-1干扰PC-12细胞对钠电流的影响.结果:低剂量NGF短时间刺激,就可以增加钠电流密度,同时这种钠电流的增加具有NGF浓度依赖性.此外,高剂量NGF刺激PC-12细胞后,细胞内的IRF-1 mRNA的表达明显增加,而较低剂量NGF刺激细胞后可以导致IRF-1蛋白向细胞核内转运,同时并不影响其基因水平表达.此外,当IRF-1被干扰后,NGF刺激则不会再出现钠电流升高.结论:NGF可以呈剂量依赖性地增加PC-12细胞的钠电流强度,同时这种增强受到了IRF-1的调控.
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神经生长因子诱导背根节感觉神经元细胞iNOS和P物质的表达及干扰素调节因子-1的作用
目的:研究神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对脊髓C7-T5背根节感觉神经元细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和P物质表达的影响及干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)的调控作用,阐明气道神经源性炎症的机制.方法:体外原代培养C7-T5脊髓背根神经节感觉神经元(DRGn)细胞,然后给予NGF或 NGF+IFN-γ刺激.采用实时荧光定量 PCR法检测经不同处理后细胞内P物质和iNOS的mRNA表达水平;再采用慢病毒GFP-IRF-1-shRNA转染DRGn细胞,观察阻断IRF-1表达后iNOS和P物质表达的变化.结果:与对照组相比,经NGF刺激后的各组细胞内P物质及iNOS mRNA水平明显升高(P＜0.01);与单纯NGF刺激组相比,NGF+IFN-γ刺激组细胞内P物质 mRNA水平无明显变化,而iNOS mRNA水平明显升高(P＜0.01);经慢病毒GFP-IRF-1-vshRNA阻断IRF-1表达后,细胞内P物质及iNOS的表达水平明显降低(P＜0.01).结论:NGF通过IRF-1调控气道感觉神经元细胞内P物质及iNOS的合成参与气道神源性炎症,IRF-1可能成为气道神经源性炎症的治疗靶点.
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TNF-α调节多聚免疫球蛋白受体和干扰素调节因子-1的表达
目的 研究TNF-α对Caco-2细胞表达多聚免疫球蛋白受体(PIGR)和干扰素调节因子-1(IRF-1)的影响.方法 用不同浓度的TNF-α刺激Caco-2细胞后,采用Real-time PCR方法检测Caco-2细胞表达PIGR和IRF-1的变化.结果 TNF-α浓度为50、100、200和400 ng/mL时,PIGR mRNA和IRF-1 mRNA的相对含量分别为(3.14±0.14)、(5.23±0.19)、(6.45±0.23)、(8.44±0.18)和(6.20±0.21)、(9.00±0.19)、(10.90±0.23)、(14.50±0.25),与无TNF-d刺激时比较,Caco-2细胞表达.PIGR和IRF-1明显增加(P＜0.01).结论 TNF-α上调Caco-2细胞中PIGR和转录因子IRF-1的表达.
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瘦素受体、IRF-1和糖皮质激素受体-β在肥胖哮喘大鼠气道平滑肌细胞中的表达
目的:观察体外培养肥胖哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)表达瘦素受体(OB-R)、干扰素调节因子-1(IRF-1)及糖皮质激素受体-β(GR-β)的情况,探讨肥胖与难治性哮喘的关系.方法:60只雄性SD大鼠随机分为四组,即正常体质量对照组(A组)、正常体质量哮喘组(B组)、肥胖对照组(C组)、肥胖哮喘组(D组),肥胖及哮喘模型建立后取各组大鼠气道,体外培养ASMC,反转录PCR(RT-PCR)测OB-R mRNA的表达,蛋白印迹法测定IRF-1及GR-β蛋白的表达.结果:OB-R mRNA的表达,B组、C组及D组较A组明显增加,D组较B组及C组明显增加；IRF-1和GR-β蛋白的表达,B组、C组及D组较A组明显增加,D组较B组及C组明显增加.结论:OB-R、IRF-1及GR-β在ASMC中表达的增加可能与肥胖哮喘发病及激素抵抗相关.
