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坐骨神经松扎致神经病理性疼痛诱导触液神经元ERK1/2蛋白的表达
目的:探讨远位触液神经元在坐骨神经松扎致神经病理性疼痛信息调控中的作用.方法:采用CB-HRP/pERK1/2双重标记技术,观察坐骨神经松扎致神经病理性疼痛大鼠远位触液神经元中ERK1/2样免疫反应蛋白(pERK1/2)表达的变化.结果:坐骨神经松扎致神经病理性疼痛刺激后,不仅热痛觉阈值显著下降,而且远位触液神经元内的ERK1/2蛋白活化表达的数量显著增加,与空白对照组比较有显著性差异.结论:远位触液神经元可能参与了机体对坐骨神经松扎致神经病理性疼痛的信息传递或调控.
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姜黄素对INS-1细胞氧化应激和胰岛素分泌的影响及新机制的初步研究
目的 采用H2O2制备INS-1氧化应激模型,观察姜黄素对INS-1细胞氧化应激水平及胰岛素分泌的影响及瓣状核酸内切酶(FEN1)和ERK1/2磷酸化的改变在其中的作用. 方法 将INS-1细胞分为阴性对照组、模型组(H2O2处理)、干预组(5、7、10 μM姜黄素+H2O2处理).采用CCK-8检测细胞增殖,分光光度计法检测细胞丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平,酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)水平的变化,放射免疫法检测细胞上清液中胰岛素分泌量,Western blot检测FEN1,p-ERK1/2蛋白表达的改变. 结果 (1)模型组MDA、ROS值较对照组明显升高(P＜0.05);干预组MDA、ROS较模型组明显降低(P＜0.05);模型组GSH较对照组明显降低(P＜0.05);干预组GSH较模型组显著升高(P＜0.05).(2)模型组胰岛素分泌水平较对照组明显降低(P＜0.05),10 μM姜黄素干预组胰岛素分泌水平较模型组明显升高(P＜0.05).(3)与模型组比较,10 μM姜黄素干预显著提高INS-1细胞FEN1蛋白的表达和ERK1/2的磷酸化,ERK1/2特异性抑制剂U0126可抑制姜黄素引起INS-1细胞FEN1蛋白表达的改变. 结论 姜黄素可以通过pERK1/2-FEN1通路改善INS-1细胞的氧化应激状态,以及胰岛素分泌,为姜黄素治疗糖尿病提供新的作用机制.
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同型半胱氨酸对小鼠成神经瘤细胞毒性作用研究
目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)对小鼠成神经瘤细胞(N2a)毒性作用并探讨其对pERK1/2蛋白表达的影响.方法:培养的N2a细胞加入不同浓度Hcy,随机分为4组:分别为正常对照组及Hcy低、Hcy中、Hcy高浓度组,根据预实验结果确定以上4组Hcy干预浓度分别为0、30、300和1 000μmol/L.作用72 h后,用酶标仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法检测细胞增殖情况,蛋白质免疫印迹法检测N2a细胞pERK1/2蛋白表达水平.结果:与正常对照组相比,Hcy低、中、高浓度组细胞培养液中LDH活性均显著升高,差异具有统计学意义(P值分别为0.013、0.008和0.011,P＜0.05).低、中、高浓度Hcy作用后,MTT检测细胞增殖活力下降,OD值降低,与对照组比较,差异具有统计学意义(P值分别为0.01、0.006和0.009,P＜0.05).各Hcy干预组pERK1/2蛋白表达量降低,且中、高浓度Hcy组pERK1/2蛋白表达量与对照组相比差异具有统计学意义(P值分别为0.038、0.007,P＜0.05).结论:Hcy能抑制磷酸化的ERK1/2蛋白表达,从而对N2a产生毒性作用,进而抑制N2a增殖,提示降低血清中Hcy水平可以对神经细胞产生保护作用.
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体外缺氧条件下新生鼠神经干细胞pERK1/2表达与叶酸的影响
背景:课题组前期实验已经证实,神经干细胞在正常培养条件下,叶酸可通过丝裂原活化蛋白激酶通路激活ERK1/2的磷酸化,进而促进神经干细胞的增殖.目的:探讨叶酸在体外缺氧条件下对神经干细胞外信号调节蛋白激酶pERK1/2表达的影响.方法:采用无血清培养法体外分离培养新生鼠神经干细胞,以1×10~8 L~(-1)接种于培养瓶,设立4组,除正常对照组外,缺氧模型组、叶酸缺乏组、叶酸添加组细胞均于第3天放入自制缺氧装置,37 ℃恒温箱中缺氧培养6 h,4组的叶酸含量分别为4 mg/L,4 mg/L,0.65 mg/L,8 mg/L.收集增殖6 d的细胞,锥虫蓝计数细胞密度,RT-PCR法检测pERK1/2 mRNA的表达,Western blot法检测pERK1/2蛋白的表达.结果与结论:与正常对照组比较,缺氧模型组神经干细胞增殖能力、pERK1/2 mRNA及蛋白的表达均明显降低.与缺氧模型组比较,叶酸添加组能促进缺氧条件下神经干细胞增殖以及pERK1/2 mRNA、蛋白的表达,而叶酸缺乏组则抑制缺氧条件下神经干细胞的增殖以及pERK1/2 mRNA、蛋白的表达,各组间比较差异有显著性意义(P < 0.001).证实添加叶酸后可激活ERK1/2磷酸化,进而促进缺氧条件下神经干细胞的增殖.
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阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导ERK信号通路的STEP61负性调控
背景:研究表明纹状体富集的酪氨酸磷酸酶61(striatal-enriched phosphatase,STEP61)在突触可塑性方面发挥重要作用.STEP位于后突触末端,影响突触增强的形成,可能的机制是使关键性信号蛋白如MAPK激酶ERK1/2去磷酸化并失活.目的:探讨STEP61负性调控阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导的ERK信号通路的机制.方法:实验分3组,正常组为C57BL/6小鼠原代皮质神经元细胞;阿尔茨海默病细胞模型组是利用1μmol/L凝聚态的β淀粉样蛋白1-42加入皮质神经元细胞中1 h作为阿尔茨海默病细胞模型;β淀粉样蛋白1-42+RNAi组为在阿尔茨海默病细胞模型基础上,利用sRNAi技术制作STEP61基因沉默组.应用Western Blot技术检测STEP61的RNAi对ERK信号通路的影响.结果与结论:Western blot结果显示,阿尔茨海默病细胞模型组与正常组相比STEP61蛋白表达增加了223％(P<0.05),使磷酸化STEP61的比例减少到(75.6±4.6)％(P<0.05).β淀粉样蛋白1-42+RNAi组STEP61磷酸化的比例与阿尔茨海默病细胞模型组相比差异无显著性意义.同时阿尔茨海默病细胞模型组pERK1/2的蛋白表达量较对照组减少(P<0.05),而β淀粉样蛋白1-42+RNAi组pERK1/2的蛋白表达量较阿尔茨海默病细胞模型组显著增加(P<0.05).结果说明:在阿尔茨海默细胞模型中证实了STEP61调控β淀粉样蛋白介导的ERKs活性,并且很可能是通过脱磷酸化使他们失活而实现的.
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人参皂苷Rb3治疗心肌梗死的分子生物学研究
目的 研究人参皂苷Rb3治疗心肌梗死的分子生物学机制.方法 采用PLM腺病毒转染人参皂苷Rb3灌胃后大鼠的心肌细胞,Western blot检测不同环境下人参皂苷Rb3对Ser68表达及细胞外调节蛋白激酶pERK1/2、凋亡抑制蛋白Survivin、MAPK通路p38,以及凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表达的影响.结果 人参皂苷Rb3在缺氧和低糖环境下,可降低Ser68磷酸化表达,提升心脏的收缩供血能力,抑制ERK1/2通过磷酸化形成pERK1/2,缓和pERK1/2对心肌细胞凋亡的加速作用.人参皂苷Rb3还可在缺氧环境下增强凋亡抑制蛋白Survivin的表达.此外,缺氧和低糖环境下,人参皂苷Rb3可以降低MAPK通路重要蛋白p38的表达,并抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的表达,改善心肌梗死.结论 在缺氧和低糖环境下,人参皂苷Rb3对心肌梗死具有积极的治疗作用.
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H-ras和pERK1/2蛋白在舌鳞癌中的表达及相互关系
目的:研究H-ras和pERK1/2蛋白在舌鳞癌组织中的表达及其相互关系.方法:采用免疫组化方法检测58例原发性舌鳞癌及20例正常癌旁组织中H-ras和pERK1/2蛋白的表达水平.结果:H-ras和pERK1/2蛋白表达在舌鳞癌阳性率显著高于癌旁组织(P＜0.05).H-ras蛋白过表达与淋巴结转移有关(P＜0.05),pERK1/2蛋白过表达与病理组织学分级有相关性(P＜0.05).结论:Ras/MAPK信号转导途径中H-ras和pERK1/2蛋白的过表达与舌鳞癌的恶性程度有密切关系.
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急性低血压对清醒大鼠前庭内侧核区pERK1/2表达的影响
[目的]探讨在清醒大鼠诱发急性低血压对前庭内侧核(MVN)区pERK1/2表达的影响.[方法]股动脉插管观察大鼠血压,股静脉插管注射给予硝普钠(SNP)诱发急性低血压,使血压下降约30%左右后,利用免疫组织化学方法观察MVN区pERK1/2表达的变化,并结合化学损伤单侧前庭器官观察可能的外周机制.[结果]股静脉注射给予清醒大鼠SNP诱发急性低血压后5,10,20,40 min时,双侧MVN区均可见明显的pERK1/2蛋白表达,而5,10 min时表达增多明显,与对照组比较差异具有统计学意义在单侧前庭器官损伤组(24 h)诱发急性低血压后的各个时间段,前庭器官损伤同侧MVN区pERK1/2阳性神经元的表达明显减少,但损伤对侧MVN区的pERK1/2表达明显增多.[结论]静脉注射给予清醒大鼠SNP诱发急性低血压可致MVN区兴奋,此作用可被破坏外周前庭器官所阻断.
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pErk1/2在干扰素-γ对干扰素调节因子-1沉默后表达Akt的32D细胞生长中的作用
目的：运用siRNA沉默干扰素调节因子-1（IRF-1）基因，观察干扰素-γ（IFN-γ）对IRF-1沉默后表达Akt的32D细胞生长增殖的作用，探讨IFN-γ由抑制造血逆转为促进造血的机制。方法：培养表达野生型Akt与无活性型Akt的32D细胞并分别转染，针对IRF-1-siRNA质粒以沉默IRF-1基因，用实时定量聚合酶链反应检测沉默效果，Western-blotting检测IRF-1蛋白表达以验证沉默效果。将处于对数生长期的两株细胞分成3大组：siRNA干扰组、空质粒阴性对照组及空白对照组，前两组分别加入不同浓度的IFN-γ共孵育，用MTS法检测两株细胞增殖情况。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；用Western-blotting检测p-Erk1/2表达。结果：（1）加IFN-γ24h后，IRF-1沉默组在IFN-γ低浓度时促进增殖，抑制凋亡。高浓度的IFN-γ仍抑制增殖，促进凋亡。在48h以后IRF-1沉默组各浓度的IFN-γ都促进增殖，抑制凋亡（P＜0.05）。（2）表达野生型Akt的32D细胞在各时间点的增殖比例都大于表达无活性型Akt的细胞。且凋亡率都小于表达无活性型Akt的各组细胞，两者在48h比较差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）表达无活性型Akt的32D细胞，加入IFN-γ后各组均上调了pErk1/2的表达（P＜0.05）。但IRF-1沉默前后，各组pErk1/2表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。表达野生型Akt的32D细胞，在IRF-1沉默后各浓度IFN-γ均下调pErk1/2的表达（P＜0.05）。结论：（1）IRF-1在IFN-γ的促凋亡作用中起重要作用。（2）有活性Akt的表达可抑制Erk信号通路，其活性状态决定了IRF-1封闭后IFN-γ对pErk1/2表达的作用，pErk1/2的表达影响细胞增殖与凋亡，但并不决定IFN-γ作用的逆转。（3）Akt信号通路在IFN-γ逆转机制中起作用。
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ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用
目的 观察角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2 对角膜基质细胞增殖的可能机制.方法 体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot 检测磷酸化ERK1/2 表达水平.结果 KGF-2 在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2 处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2 磷酸化表达水平逐渐减弱;20 μmol·L-1 ERK1/2抑制剂PD98059 可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用.结论 KGF-2 激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059 阻断; ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用.
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选择性β3受体激动剂对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响及机制
目的 探讨选择性β3受体激动剂BRL37344对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响及ERK1/2分子磷酸化在此过程中的作用.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,不同药物干预一定时间后裂解细胞收集蛋白,应用Western blot法检测PPARγ、ERK1/2及pERK1/2蛋白表达.结果 10-7 mol/L BRL37344可以显著提高3T3-L1前体脂肪细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平,下调PPARγ表达.部分阻断BRL37344引起的ERK1/2磷酸化可以恢复PPARγ表达.结论 10-7 mol/L BRL37344引起的ERK1/2长时间高水平磷酸化在抑制3T3-L1细胞分化过程中起着十分重要的作用.
关键词： 肥胖 选择性β3受体激动剂 pERK1/2 3T3-L1前体脂肪细胞 -
pERK1/2在大鼠脑内的分布及Y迷宫训练后的时程变化
目的明确pERK1/2在大鼠脑内的分布及Y迷宫训练后的时程变化.方法 55只健康成年SD大鼠,分为正常对照组,Y迷宫训练组,假训练组,其中训练组与假训练组再各分为训练后0h、1h、3h、6h、24h亚组,每组动物各5只.训练组动物接受Y-迷宫光电结合训练,假训练组动物接受光电不结合假训练,应用免疫组织化学方法检测各组大鼠脑内各区pERK1/2阳性神经元分布及表达的变化.结果正常对照组pERK1/2免疫阳性神经元分布较少,但在双侧视上核、室旁核表达很丰富,其次在小脑分子层和浦肯野细胞层、杏仁核、纹状皮层表达较多,海马部位偶见2～5个阳性神经元,有较多阳性纤维着色,在纹状体整个区域无阳性神经元表达.在训练后0h纹状体尾壳核和边缘区[(31.2±4.8)个]出现表达,在海马CA2、CA3区出现较多阳性神经元胞体[(44.2±4.2)个],皮层大部、杏仁核的表达也有明显增强,而训练后1h、3h、6h上述各区仍有持续增强,训练后24h表达降至正常,纹状体边缘区阳性神经元消失,海马部位仅有个别阳性神经元[(3.8±3.3)个],P值均小于0.01.假训练组各时间点在海马、纹状体尾壳核、边缘区等部位均无或仅有个别阳性细胞或阳性纤维,与训练组相比差异显著.结论正常状态下pERK1/2在全脑分布较为局限,且表达强度较低.Y迷宫学习可诱导海马、尾壳核、纹状体边缘区等区域的pERK1/2的表达,而且pERK1/2参与了Y迷宫的习得、短期记忆的形成、短期记忆向长期记忆的转换和长期记忆的形成等学习记忆的各个阶段.
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大鼠弥漫性脑损伤阻滞ERK通路下调脑组织MMP-9 mRNA的表达
目的探讨大鼠弥漫性脑损伤后磷酸化ERK1/2和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的变化规律及相互作用关系,从而进一步理解ERK1/2在弥漫性脑损伤中的作用及其对脑的保护机制.方法按Mamarou方法制作大鼠重型弥漫性脑损伤模型,尾静脉注射ERK通路阻滞剂U0126;Western blot法检测磷酸化ERK1/2;RT-PCR检测MMP-9 mRNA;干湿重法测脑组织含水量.结果弥漫性脑损伤后磷酸化ERK1/2表达迅速增高,持续高水平表达至72 h.MMP-9 mRNA在损伤后3 h开始上升,24h达高峰,可维持较高水平直至7 d.注射U0126后,磷酸化ERK1/2表达明显下降(P＜0.01),MMp-9 mRNA表达亦明显下降(P＜0.05),脑组织含水量减少(P＜0.05).结论大鼠重型弥漫性脑损伤后ERK1/2被过度激活,MMP-9 mRNA表达增高,通过阻滞ERK通路可以下调MMP-9 mRNA的表达,保护受损脑组织.
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溃结灵对UC大鼠结肠黏膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白水平的影响
目的 观察渍结灵对TNBS法UC大鼠模型结肠黏膜pERK1/2、pMEK1/2蛋白水平的影响,并对其作用机制进行探讨.方法 采用溃结灵对TNBS法UC大鼠模型进行治疗,治疗结束后采集结肠黏膜标本并提取全细胞蛋白,运用蛋白免疫印迹(Western blot)方法对PERK1/2和PMEK1/2的蛋白表达水平进行检测,以β-actin作为内参,以目的蛋白与β-actin密度的比值作为目的蛋白的相对含量,进行组间比较分析.结果 模型组pERK1/2、pMEK1/2蛋白相对表达量分别是0.3974 ± 0.1017和0.6994 ± 0.1372,均高于正常组(分别为0.2037±0.1234、0.4092 ± 0.1177,P>0.05,P<0.01);溃结灵组相对表达量分别为0.7060±0.1607和0.8928±0.1801,明显高于模型组(P<0.01,P<0.05);SASP组相对表达量分别为0.7299±0.2710和0.9053±0.1591,明显高于模型组(P<0.01,P<0.05.结论 溃结灵对TNBS法UC大鼠模型结肠黏膜pERK1/2、pMEK 1/2蛋白表达有上调作用,提示溃结灵治疗作用可能与激活ERK信号转导途径有关.
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七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力及海马pERK1/2表达的影响
目的：探讨七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力及海马pERK1/2表达的影响。方法出生后14 d SD幼鼠54只，随机分为对照组(C组)、七氟醚5%组(Sevo组)、假手术组(Sham组)各18只。C组不做任何处理，Sevo组幼鼠暴露于5%的七氟醚4 h，Sham组幼鼠吸入氧气4 h，1周、3周、6周后于上午8：00~11：00应用Morris水迷宫对幼鼠进行7d的行为学观察，记录逃避潜伏期，行为学结束后随即取出6只幼鼠用免疫组化法测定海马CA1区神经元pERK1/2的表达。结果与Sham组比较，Sevo组逃避潜伏期和探索时间明显延长(P<0.01)，Sevo组海马CA1区神经元pERK1/2的表达明显减少(P<0.01)；Sham组与C组逃避潜伏期时间差异无统计学意义，海马CA1区神经元pERK1/2的表达之间差异无统计学意义。结论七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力的影响与抑制海马pERK1/2表达有关。
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大鼠同性别社会交往引起主嗅觉系统相关脑区pERK1/2表达变化
目的:探讨大鼠同性别社会交往行为脑内pERK1/2的表达与可能作用.方法:采用三箱室社会交往箱检测雄性大鼠同性别社会交往行为,运用免疫组织化学染色观察动物10 min社会交往行为后脑内pERK1/2的表达;采用10％硫酸锌(ZnSO4)滴鼻嗅觉剥夺后观察大鼠同性别社会交往行为以及脑pERK1/2的表达状况.结果:大鼠呈现明显的同性别社会交往偏好;社会交往后,pERK1/2在与主嗅觉系统相关的脑区(如主嗅球、内嗅皮质、梨状皮质等)以及眶额皮质、前扣带皮质等脑区表达明显增加;嗅觉剥夺后大鼠的同性别社会交往行为显著减少,pERK1/2在主嗅觉系统相关脑区表达明显下降.结论:主嗅觉系统参与了雄性大鼠同性别社会交往行为,pERK1/2表达水平变化随着社会交往行为改变而改变,提示ERK1/2信号通路可能参与大鼠同性别社会交往行为.
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强迫游泳大鼠脑内信号分子ERK1/2磷酸化水平的变化
通过观察强迫游泳时大鼠脑内不同核团内ERK1/2磷酸化水平变化,探讨与负性心理应激有关的脑内环路.将大鼠置于高60cm、水深约30 cm的玻璃缸内,先预游15 min,24 h后进行5 min的强迫游泳,观察大鼠游泳过程中的不动时间.游泳完毕后将大鼠灌流处死,对全脑组织进行磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的免疫组织化学染色及其与酪氨酸羟化酶(TH)在部分核团内的免疫荧光双标细胞.强迫游泳后前额叶皮质、外侧隔区、下丘脑室旁核、海马CA1-3区、杏仁内侧亚核和皮质亚核、孤束核等脑区/核团中pERK1/2阳性细胞数显著增多;而杏仁中央亚核、下丘脑视上核内的磷酸化ERK1/2蛋白水平下降,阳性细胞数明显减少.免疫荧光双标结果表明,孤束核内部分pERK1/2阳性细胞呈TH免疫反应阳性.上述结果表明,以上脑区/核团内的神经元可能和负性心理应激的中枢调控有关,ERK1/2信号通路参与了其调控过程.此外,孤束核中的儿茶酚胺能神经元可能参与了心理应激的脑内活动.
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H-ras和pERK1/2蛋白在口腔鳞癌中的表达及其临床意义的研究
目的研究Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径中H-ras和pERK1/2蛋白在口腔鳞癌组织的表达及其临床意义.方法采用免疫组化方法对42例口腔鳞癌组织及10例正常口腔粘膜组织进行H-ras和pERK1/2蛋白表达的检测.结果H-ras和pERK1/2蛋白在口腔鳞癌组织中呈过表达,其阳性率分别为61.5%和57.8%,明显高于正常口腔粘膜组织(P＜0.01).H-ras蛋白表达程度与淋巴结转移有关(P＜0.05),pERK1/2蛋白表达程度与鳞癌病理组织学分级相关(P＜0.05).结论Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径与口腔鳞癌淋巴结转移和细胞增殖状态有密切关系.
