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壳聚糖-透明质酸共混膜对兔角膜基质细胞生长的影响
观察各种壳聚糖-透明质酸共混膜对角膜基质细胞生长的影响作用,研究透明质酸混入比例对共混膜与细胞相容性的影响.以共混膜为载体培养兔角膜基质细胞,通过光学和电子显微镜,观察细胞在膜上的生长情况;通过MTT法,检测细胞在共混膜上的贴附率和生长活性;通过检测培养基中乳酸脱氢酶的活性,预示壳聚糖-透明质酸共混膜与角膜基质细胞的相容性.以低于1:0.1的比例混入透明质酸.可以提高细胞在共混膜上的贴附率、生长速度,细胞在共混膜上的生长状态好于在壳聚糖膜上的生长状态.结果提示,以低于1:0.1的比例混入透明质酸,可以提高壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性,促进细胞生长;而以高于1:0.1的比例混入透明质酸,则不利于细胞在共混膜上的生长,降低了壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性.
关键词： 壳聚糖-透明质酸共混膜 角膜基质细胞 相容性 -
壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞相容性的影响
以脱乙酰度为95%,相对分子量分别为130 KDa、220KDa、 300KDa和500 KDa的壳聚糖制备不同的壳聚糖膜.以各种壳聚糖膜作为基质,体外培养兔角膜基质细胞,通过观察角膜基质细胞在不同壳聚糖膜上的生长状态、贴附情况、生长曲线以及乳酸脱氢酶的活性,研究壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞生物相容性的影响.实验结果表明壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性具有重要的影响,相对分子量过高或过低的情况下,壳聚糖膜与角膜基质细胞相容性较差,对细胞损伤程度较大,细胞在膜上的贴附、生长能力较差;以相对分子量在200KDa～300KDa之间的壳聚糖制备出的膜与角膜细胞具有较好的相容性,细胞可在膜上长成密集单层,适合作为角膜培养的支架材料.
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牛磺酸对角膜基质细胞增殖和移行的影响
目的:观察牛磺酸(taurine)对体外培养的兔角膜基质细胞增殖和移行的影响.方法:将原代培养的兔角膜基质细胞传至2代～3代用于实验,分别加入不同浓度的牛磺酸,用细胞计数法和MTT法检测牛磺酸对角膜基质细胞增殖的影响;用缺损闭合法观察牛磺酸对角膜基质细胞移行的影响.结果:细胞计数法和MTT法均显示牛磺酸浓度≥100 mmol/L时对兔角膜基质细胞增殖均有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性.缺损闭合法显示牛磺酸对角膜基质细胞移行具有抑制作用.牛磺酸浓度低于100 mmol/L时对兔角膜基质细胞抑制作用不明显. 结论牛磺酸具有抑制兔角膜基质细胞增殖和移行的作用,对于防治角膜创伤修复后瘢痕形成,特别是准分子激光术后角膜上皮下雾状混浊的形成具有十分重要的意义.
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角膜基质细胞的表型转化及其预防瘢痕形成的研究
正常情况下角膜基质细胞处于静止状态,受损伤时易发生表型及生理功能的改变,转换为成纤维细胞或肌成纤维细胞.不同的损伤因子影响角膜细胞的应答反应,决定角膜组织是完全修复还是形成瘢痕组织.角膜基质细胞合成分泌多种细胞外基质,活化的角膜基质细胞利于角膜损伤修复,角膜肌成纤维细胞可致角膜表面混浊,损伤、细菌或病毒感染等因素导致角膜受损后修复产生瘢痕,富血小板血浆、转化生长因子β等生化因子在表型转换、瘢痕组织的临床治疗和预防等方面起重要作用.
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角膜基质细胞研究进展
角膜基质细胞,存在于角膜基质层中,在正常情况下,处于静止状态.但当角膜损伤时,不同上皮来源的因子及环境信号,将影响角膜基质细胞的应答反应,决定着角膜能否完全被修复或形成角膜瘢痕.本文就角膜基质细胞的分布、形态、受激后的应答反应情况及与角膜疾病的关系作一综述.
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血清在构建角膜基质细胞体外三维培养模型中的作用
目的 研究血清在构建角膜基质细胞体外三维培养模型中对细胞生长情况及胶原纤维生成的影响,为体外研究角膜基质细胞外基质(ECM)纤维化提供新的培养模型.设计 实验研究.研究对象 牛角膜基质细胞.方法 分离原代牛角膜基质细胞,取第一代细胞作为种子细胞构建Pellet模型,实验分为对照组(DMEM/F12)和血清组(DMEM/F12+10％胎牛血清FBS).Pellet模型培养3周后,肉眼观察细胞生长状态,同时进行HE染色及Calcein AM/PI染色测定细胞活性,并应用MASSON染色及透射电子显微镜(TEM)观察胶原纤维的形成、走向及排列情况.主要指标 细胞生长状态、细胞活性、胶原纤维走向及排列情况.结果 Pellet模型培养3周后,对照组未观察到角膜基质细胞抱团生长现象,且细胞易松散,难以进行后续实验;血清组Pellet模型中细胞明显成簇生长,呈粒状,结合牢固.Calcein AM/PI染色及HE染色可见血清组大多数细胞存活且密集生长,细胞结构完整.MASSON染色示血清组较多胶原纤维显色,并于TEM下观察到胶原纤维密集分布于细胞外且走向紊乱.结论 含血清的培养环境能成功构建牛角膜基质细胞体外Pellet三维培养模型,且能生成含有胶原纤维的ECM.
关键词： Pellet三维培养模型 角膜基质细胞 血清 细胞外基质 胶原纤维 -
TSLPR/STAT5信号通路在角膜基质细胞抗烟曲霉菌感染免疫调控的体外研究
目的 研究胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)/信号转录活化子5(STAT5)在人角膜基质细胞(THSF)抗烟曲霉菌感染免疫中的作用.方法 实验研究.免疫荧光检测正常培养条件下角膜基质细胞TSLPR的表达.将人重组TSLP蛋白(hTSLP)添加至培养基中,于5、15、30、60 min收取细胞,免疫印迹法检测磷酸化STAT5(p-STAT5)和STAT5的蛋白表达.烟曲霉菌刺激细胞后,于1、3、6、12、24、48 h收取细胞,RT-PCR检测TSLPR和IL-7Rα的mRNA表达;于刺激后12、24、48 h收取细胞,免疫印迹法检测TSLPR、p-STAT5和STAT5的蛋白表达.中和性抗体封闭TSLPR受体后,烟曲霉菌刺激细胞24h,免疫印迹法检测p-STAT5和STAT5的蛋白表达.组间均数的比较采用单因素方差分析,均数间的多重比较采用LSD-t检验;组间均数的两两比较采用独立样本个t检验.结果 免疫荧光显示,THSF可见绿色荧光,正常THSF表达TSLPR;人重组TSLP蛋白刺激细胞后,免疫印迹法显示p-STAT5增多,至30 min时达峰(烟曲霉菌组:8.87±0.75;对照组:1.00±0.14),差异有统计学意义(P＜0.0l).烟曲霉菌刺激细胞后3、6、12、24h TSLPR mRNA (0.000 50±0.000 07、0.001 20±0.000 11、0.002 30±0.000 25、0.001 70±0.000 17)较对照组(0.000 20±0.000 03、0.000 20±0.000 05、0.000 20±0.000 03、0.000 20±0.000 04)表达增多,差异均有统计学意义(t=-9.955,-17.329,-16.735,-18.214;P＜0.01);IL-7RαmRNA的表达无明显变化(t=-0.684,-0.029,-0.319,-1.034;P＞0.05).免疫印迹法检测结果显示,烟曲霉菌刺激后24 h p-STAT5和TSLPR的表达较对照组明显增多(p-STAT5:9.46±2.08,1.00±0.06;TSLPR:l.80±0.27,1.00±0.34),差异有统计学意义(t=-7.055,-3.170,P＜0.01).中和性抗体封闭TSLPR受体后,p-STAT5的表达减少(anti-TSLPR-烟曲霉菌:0.55±0.20;CTR Ab-烟曲霉菌:1.00±0.08),差异有统计学意义(t=3.506,P＜0.05).结论 TSLP/TSLPR/STAT5信号通路在角膜基质细胞抗烟曲霉菌感染中发挥重要作用.
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三维细胞培养技术在眼科领域的应用进展
三维细胞培养技术是一种利用支架材料将体外细胞进行三维空间培养的技术,具有体内微环境模拟度高于二维平面细胞培养模式,可控性强于动物实验等优点.近年来,随着组织工程学技术的发展,各种生物学材料支架应运而生,为三维细胞培养技术提供了有利的平台.在眼科方面,三维细胞培养技术已应用于角膜、视网膜、视觉系统发育及多种眼肿瘤等方面的研究中.本文就三维细胞培养技术在眼科基础研究和临床疾病诊疗方面的应用进行综述.
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异种脱细胞角膜基质囊袋移植的生物相容性研究
目的探讨脱细胞猪角膜基质移植入兔角膜囊袋后的生物学反应.方法猪角膜通过不同方式去除细胞及免疫源性成分,保留角膜组织基质的弹力纤维及胶原纤维,将其切取为直径为4mm的植片,植入兔角膜囊袋内,在不同时间点观察生物材料在角膜内生物学反应.结果材料植入兔角膜囊袋3个月,生物相容性良好,材料逐渐降解,材料内有胶原和角膜基质细胞长入.结论新型可降解角膜基质材料植入后未见兔角膜有明显的炎症反应,材料的组织相容性好,可作为组织工程角膜的支架材料.
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体外培养人角膜缘上皮细胞抑制激活态角膜基质细胞的生长
背景:角膜受到损伤后,角膜基质细胞激活转变为成纤维细胞,引起角膜基质瘢痕化,导致视力下降甚至丧失.目的:观察角膜不同部位上皮细胞与角膜基质细胞的相互作用,探索角膜缘上皮细胞群能否抑制激活态角膜基质细胞的生长.方法:采用酶消化及机械外力相结合的方法获取人角膜中央、角膜旁中央及角膜缘处角膜上皮细胞与浅层角膜基质细胞,进行体外培养.相差显微镜下观察细胞形态及生长变化.待培养角膜上皮细胞与基质细胞发生接触抑制时,记作"0 周",采用免疫荧光染色技术检测培养细胞中PCNA及p63蛋白的表达.结果与结论:培养的角膜上皮细胞与成纤维细胞发生接触抑制时,两种细胞间有明显分界线.角膜缘组上皮细胞中PCNA及p63蛋白均有较高的表达;角膜旁中央组PCNA有较高的表达,p63蛋白阴性表达;角膜中央组PCNA表达较低,p63蛋白阴性表达;从鉴定结果中可以得出只有角膜缘组中存在一定比例的角膜缘上皮干细胞.角膜缘组上皮细胞逐渐包围并化解成纤维细胞,在相互作用4周后,成纤维细胞聚集成死细胞团,缺乏角膜缘干细胞的中央组及旁中央组中成纤维细胞生长面积增加,上皮细胞生长受到抑制甚至死亡.说明体外培养的角膜缘上皮细胞群可以抑制激活态角膜基质细胞的生长.
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角膜基质细胞基质金属蛋白酶1，2活性与组织因子途径抑制物2的效应
背景：有研究表明，基质金属蛋白酶所参与的细胞外基质降解在角膜新生血管形成过程中起关键作用，组织因子途径抑制物2是新近发现的一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制物，能有效抑制基质金属蛋白酶的活性。
目的：观察组织因子途径抑制物2对体外角膜基质细胞表达基质金属蛋白酶活性的关系。
方法：在体外对兔角膜基质细胞进行原代及传代培养，用脂质体介导的人类组织因子途径抑制物2真核表达载体转染兔角膜基质细胞，G418筛选阳性细胞。
结果与结论：RT-PCR，Western blot及明胶酶谱法分析结果显示，转染后角膜基质细胞组织因子途径抑制物2 mRNA和蛋白质的表达均上调(P<0.05)，而基质金属蛋白酶1，2的活性下降(P<0.05)。结果提示，组织因子途径抑制物2可明显抑制角膜基质细胞中基质金属蛋白酶1，2的活性。 -
维甲酸对人角膜基质细胞增殖和移行的影响
目的:探讨维甲酸对角膜基质创伤愈合的可能的作用.方法:利用细胞计数法、MTT法观察维甲酸对培养的人角膜基质细胞增殖的影响;利用缺损闭合实验观察维甲酸对培养的人角膜基质细胞移行的影响.结果:MTT法和细胞计数法显示,维甲酸抑制体外培养的人角膜基质细胞增殖,抑制作用呈剂量、时间依赖性(F检验,P＜0.05),抑制率在11.4%～39.2%.细胞计数法还显示,O.5%苔芬兰染色示各组活细胞率均在90%以上,未见细胞毒性.缺损闭合实验表明,10-6M维甲酸组缺损平均愈合天数明显长于对照组.结论:维甲酸抑制培养的人角膜基质细胞增殖、移行.这些结论为进一步理解控制角膜基质细胞生长分化的机理,为研究控制角膜创伤愈合瘢痕奠定了初步的理论基础.
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角膜基质细胞Toll样受体4对茄病镰刀菌炎性反应的实验研究
目的 检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达分布状况,探讨TLR4与炎性因子分泌的关系.方法 对小鼠角膜基质细胞进行原代培养和鉴定；制备茄病镰刀菌液；MTT法观察菌液刺激对角膜基质细胞生长作用的影响；免疫组化、RT-PCR测定刺激后不同时间点角膜基质细胞TLR4的表达；ELISA检测封闭TLR4对菌液诱导的角膜基质细胞分泌TNF-α、IL-8的影响.结果 采用消化法1～2 d培养出小鼠角膜基质细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色阳性；菌液刺激48h后,MTT法显示刺激组较对照组OD值明显下降；正常角膜基质细胞TLR4在蛋白及mRNA水平呈弱表达,刺激6h可达到高峰,12h开始逐渐降低；菌液可上调角膜基质细胞TNF-α、IL-8的释放,刺激3h、6h、12 h的TNF-α、IL-8的浓度与TLR4 mRNA的表达呈明显的正相关(P＜0.05);预先封闭TLR4,可明显降低TNF-αt、IL-8的释放.各时间组间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 角膜可能通过TLR4识别真菌感染,TLR4在角膜对真菌的免疫炎性防御反应中起到重要作用.
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地塞米松抑制多核白细胞诱导的角膜基质细胞胶原降解
目的探讨地塞米松对多核白细胞诱导的角膜基质细胞胶原降解作用及机制.方法利用角膜基质细胞三维胶原凝胶培养模型,加入多核白细胞或其培养上清及不同浓度地塞米松,在MEM培养液中培养48 h后,通过测定培养上清液中的羟脯氨酸(HYP)的量作为胶原降解的活性单位.免疫印记法分析MMP活性变化.结果在纤维蛋白溶酶原存在的情况下,多核白细胞单独无胶原降解作用,多核白细胞与角膜基质细胞混合培养,及多核白细胞培养上清均能增加角膜基质细胞胶原降解量,差异有显著性(P＜0.01);多核白细胞培养上清能够刺激角膜基质细胞MMP-1和MMP-3释放,地塞米松依浓度依赖关系减少角膜基质细胞胶原降解量,差异有显著性(P＜0.01).结论多核白细胞促进角膜基质细胞胶原降解,地塞米松具有抑制多核白细胞诱导的角膜基质细胞胶原降解的作用.
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多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1诱导下对角膜基质细胞胶原降解的作用
目的 观察多核白细胞弹性蛋白酶及白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)对人角膜基质细胞胶原降解作用的影响,探讨角膜溃疡的发生机理.方法 角膜基质细胞三维胶原凝胶模型表面添加含多核白细胞弹性蛋白酶及IL-1α的MEM液,培养5天,通过测定培养液中的羟脯氨酸(HYP)的量作为胶原降解活性单位.结果 多核白细胞弹性蛋白酶直接降解Ⅰ型胶原,但对角膜基质细胞胶原降解无明显影响,同时添加弹性蛋白酶和IL-1α,明显增加角膜基质细胞胶原降解.结论 多核白细胞弹性蛋白酶和IL-1α协同作用促进角膜基质细胞胶原降解,可能在角膜溃疡的发生过程中起着重要的作用.
关键词： 多核白细胞弹性蛋白酶 白细胞介素1α 角膜基质细胞 胶原降解 -
血清对角膜基质细胞介导下绿脓杆菌引起的角膜胶原降解作用的实验研究
目的 探讨血清在绿脓杆菌和角膜基质细胞介导的角膜胶原降解时的作用.方法 Ⅰ型胶原凝胶,不混悬及混悬角膜基质细胞,在不同的血清浓度下(0、5%、10%、20%)与绿脓杆菌培养液共同培养24h,超滤去除天然原纤维,超滤液经过水解,分光光度计测定其羟脯氨酸(HYP)的量作为胶原降解的活性单位.结果 不混悬角膜基质细胞组,随血清浓度增加绿脓杆菌所引起的胶原降解量无变化,差异无显著性(P＞0.05);混悬角膜基质细胞组,随着血清浓度增加绿脓杆菌所引起的胶原降解量减少,差异有显著性(P＜0.025 or P＜0.05);在相同的血清浓度(0、5%、10%)时,混悬角膜基质细胞组胶原降解量高于不混悬角膜基质细胞组,差异有显著性(P＜0.025 or P＜0.05).结论 血清中的某些活性成分可抑制绿脓杆菌诱导的角膜基质细胞胶原降解.
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多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2、MMP-9表达的影响
目的 观察多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素-1α对人角膜基质细胞表达的MMP-2、MMP-9的影响,进而探讨角膜溃疡的发生机理.方法 体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或白细胞介素-1α,培养5天,通过明胶酶谱分析的方法测定培养上清中的MMP-2和MMP-9的表达.结果 体外培养的人角膜基质细胞无任何刺激下可释放MMP-2;白细胞介素-1α可加强并激活MMP-2的表达,同时可诱导MMP-9前体的释放;多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1α诱导下可完全激活前体MMP-9转化为活化形式.结论多核白细胞弹性蛋白酶和白细胞介素-1α协同作用参与角膜溃疡的发生.
关键词： 多核白细胞弹性蛋白酶 白细胞介素-1α 角膜基质细胞 MMP-2 MMP-9 -
多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-1、MMP-3表达的影响
目的 探讨多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素(IL)-1α对人角膜基质细胞MMP-1、-3表达的影响.方法 体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL-1α,培养5 d,通过免疫印迹分析法测定培养上清中的MMP-1、-3的表达.结果 在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP-1、-3;添加IL-1α后可诱导前体MMP-1、-3表达,而添加多核白细胞弹性蛋白酶不能诱导MMP-1、-3的表达;多核白细胞弹性蛋白酶可激活在IL-1α诱导下产生的前体MMP-1、-3转化为活化形式的MMP-1、-3.结论 多核白细胞弹性蛋白酶和IL-1α可协同诱导角膜基质细胞的胶原降解,诱发角膜溃疡的发生.
关键词： 多核白细胞弹性蛋白酶 白细胞介素-1α 角膜基质细胞 MMp-1 MMP-3 -
胶原-壳聚糖和角膜基质细胞复合膜的构建及其生物相容性
目的:探讨以胶原-壳聚糖为生物支架构建角膜基质细胞复合膜及其生物相容性.方法:兔和人角膜基质细胞分离培养后种植到胶原-壳聚糖共混膜上,构建成复合膜后移植到异体大耳白兔角膜基质囊袋中,术后1、2和4周时分别于活体进行前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化检测,观察复合膜中角膜基质细胞生长状态、生物支架对正常角膜细胞的影响及生物膜的降解情况.结果:活体前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化观察结果显示,兔和人角膜基质细胞在胶原-壳聚糖共混膜上生长良好,移植后复合膜逐渐发生降解,角膜组织未发生坏死和溶解,角膜上皮、基质和内皮细胞形态结构正常.结论:胶原-壳聚糖可作为角膜基质构建的生物支架,角膜共焦显微镜及前节OCT作为新的手段可活体观察构建后的角膜基质生物学活性.
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细菌纤维素构建组织工程角膜基质的方法及其评价
目的:探讨以细菌纤维素(BC)为支架构建组织工程角膜基质的可行性.方法:体外分离培养兔和人角膜基质细胞.种植到BC膜中,构建完成后进行兔和人角膜基质细胞-BC复合膜的生物检测,并将兔角膜细胞生物复合物进行同种异体移植.术后1、4和8周时分别活体行前节OCT、角膜共焦显微镜检查,离体后组织学及免疫组织化学检查.结果:人和兔角膜基质细胞长入BC的网架结构,细胞生长状态良好.移植术后1周兔眼无炎症反应及新生血管,4周后植片边缘出现新生血管,表面无水肿及溃疡形成.术后8周角膜共焦显微镜显示:移植片周围基质细胞增生活跃,邻近的角膜内皮细胞数量和形态正常.前节OCT显示:移植后复合膜逐渐降解,4周时复合膜边界模糊,8周时密度接近正常角膜组织.离体组织学检查显示:BC复合膜与正常角膜基质相似,有炎细胞浸润和血管形成,角膜组织无坏死和溶解.结论:BC无细胞毒性,具有良好的组织相容性和可降解性,可作为构建组织工程角膜基质的生物支架.
