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EGFP-CIDE-3及DsRed 1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位
目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.
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人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达
目的: 构建人CIDE-3基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法: 提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA, 经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段, 并将其克隆入原核表达载体pET28a(+)中, 构建重组质粒pET28a(+)-CIDE-3.经限制性内切酶BamH I、 Xho I双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21(DE3), 经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白.结果: 获得全长为516 bp的人CIDE-3基因片段.以构建的重组质粒pET28a(+)-CIDE-3转化E.coli BL21(DE3)后, 经IPTG诱导, 表达出相对分子质量(Mr)约为23 000的重组CIDE-3蛋白.SDS-PAGE分析显示, 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中, 表达量约占全菌蛋白的32%.结论: 成功地构建了原核表达载体pET28a(+)-CIDE-3, 并表达出重组CIDE-3蛋白, 为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础.
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酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测
目的:构建并转化酵母双杂交体系中“诱饵”载体pGBKT7-cide-3以便用于人肝cDNA文库的筛选.方法:用RT-PCR方法从人肝细胞株QZG中扩增cide-3基因全外显子片段,并定向克隆入细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7中；用PEG/LiAC法将pGBKT7-cide-3转化感受态酵母菌AH109.提取转化酵母菌的质粒DNA和总蛋白进行鉴定.同时检测表达产物对报告基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性.结果:成功扩增出人cide-3 cDNA片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pGBKT7-cide-3；获得可在色氨酸缺陷培养基(SD/-Trp)上生长含pGBKT7-cide-3的酵母菌克隆.鉴定表明pG-BKT7-cide-3已转化入酵母菌AH109,无自主激活报告基因的能力及对酵母的生长无毒性.结论:酵母双杂交“诱饵”载体pGBKT7-cide-3构建获得成功,可应用于酵母双杂交体系.
