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乳腺高效表达人溶菌酶转基因小鼠的制备
目的研究自行构建的动物乳腺特异表达载体p205C3的表达特性. 方法将人溶菌酶(hLYZ) cDNA插入p205C3载体,用获得的基因构件注射小鼠受精卵,用PCR和Southern blot对出生鼠进行基因整合检测,用微球菌溶解试验和Western blot对表达产物进行鉴定. 结果共出生136只F0代小鼠,从中筛选出4只(1♀3♂)转基因整合阳性鼠,其中的1只母鼠不表达hLYZ,1只雄鼠的4只F1代母鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为5、75、175和200μg/ml,纯合后的3只F3代母鼠乳汁中 hLYZ的表达量分别为526μg/ml、648μg/ml和750μg/ml,表达仅限于乳腺中,表达产物的相对分子质量与正常hLYZ相同. 结论 p205C3能驱动hLYZ cDNA在小鼠乳腺中特异和高效表达,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.
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甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位
目的 利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,M)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础.方法 为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化.毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞.结果 毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致.该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生.结论 毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞.
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人溶菌酶cDNA克隆与CHO/dhfr-细胞中的分泌性表达
目的 探讨人溶菌酶(hLYZ) cDNA的克隆及在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)中的分泌性表达.方法 采用RT-PCR的方法,从人胎盘组织中克隆hLYZ cDNA,构建hLYZ真核分泌性表达载体,科用脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选得到表达hLYZ的CHO抗性细胞株.结果 hLYZ基因成功连接到真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB上,hLYZ融合蛋白在二氢叶酸还原酶/CHO-k1表达系统中得到成功表达.结论 成功构建真核可溶性表达载体pSecTag 2/Hypro-hLYZ,为规模化、工程化生产hLYZ奠定基础.
关键词： 人溶菌酶 CHO/dhfr-细胞 真核表达 脂质体共转染 -
人溶菌酶cDNA在COS-1细胞及小鼠乳腺的暂态表达
目的研究自行克隆的1.5kbhLYZ双链cDNA的表达特性.方法将此cDNA亚克隆人真核表达载体pcDNA3及乳腺特异表达载体p205C3,重组载体pcDNA3LYZ转染COS-1细胞,用间接免疫荧光法检测转染细胞中hLYZ cDNA的表达;重组载体p205C3LYZ注射哺乳期小鼠,用微球菌溶解试验和斑点杂交试验检测hLYZ cDNA在小鼠体内的表达.结果hLYZ cDNA在转染的COS-1细胞中得到了正确表达;小鼠体内表达并分泌到乳汁中的hLYZ达87μg/ml,且目的基因的表达具有较好的组织特异性.结论hLYZ cDNA可在COS-1细胞中有效表达,基因构件p205C3LYZ可以用于动物乳腺生物反应器研制.
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人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性
目的 在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性.方法 将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),终IPTG诱导表达.表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性.结果 经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确.SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40 000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达.纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性.重组hLYZ酶活性为2 389 U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用.结论 已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性.
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人溶菌酶基因免疫抗体的制备及其初步应用
目的制备人溶菌酶(hLYZ)基因免疫抗体.方法用多聚乙酰亚胺包裹重组质粒pcDNA3LYZ,经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA检测免疫血清中hLYZ抗体的效价,所得抗体用Western-blotting法检测转基因小鼠乳汁中重组hLYZ的表达情况.结果 2次免疫后,小鼠体内产生了hLYZ特异性抗体,效价达1:800,用此抗体为第一抗体在转基因小鼠乳汁中检测到分子量与正常hLYZ相同的重组hLYZ.结论用基因免疫方法在小鼠体内制备了可用于检测的hLYZ抗体.
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转基因小鼠乳汁中重组人溶菌酶活性的检测
目的:摸索精确检测本室制备的人溶菌酶(hLYZ)转基因小鼠乳汁中重组酶表达量的方法.方法:对溶菌酶检测的两种常规方法-琼脂平板扩散法和光学比浊法进行了改进,并以hLYZ标准品为检测对象,比较了改进后两种方法的优缺点.采用改进后的琼脂平板扩散法对转基因小鼠乳汁中表达的重组hLYZ进行检测.结果:在敏感性和可重复性方面,此两种方法无明显差别,但琼脂平板扩散法无特殊要求且简便易行.结论:改进的琼脂平板扩散法是一种更适宜于检测大批量微量样品中LYZ活性的良好方法.
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家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的生物信息学分析
目的 利用生物信息学方法分析家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因推导的氨基酸序列.方法 用ProtParam Tool、CDD、ProtScal、sopma等软件对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、功能结构域及蛋白质二级结构等重要参数进行预测.结果 家蝇天蚕素-人溶菌酶由l87个氨基酸组成,预测相对分子质量为20 131.7,理论等电点(pI)为9.69,分子式为C862 H1375 N277 O260 S11；半衰期预测结果显示其利于基因工程表达.融合蛋白的氨基酸序列含有天蚕素家族和溶菌酶家族二者的保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成.结论 分析结果为家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因的原核表达及表达产物的生物学功能研究奠定了基础.
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人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达
目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.
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转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立
目的研究人溶菌酶(human lysozyme, hLYZ)动物乳腺生物反应器制备的可行性.方法将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接,所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠.结果共出生了136只F0代小鼠,PCR和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5.15%(2♀5♂)和2.94%(1♀3♂).Western印迹检测结果表明,分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量.目前转基因小鼠已经繁殖到F7代,每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ,乳汁中的表达量高达750 mg/L.斑点杂交试验证明,表达有较强的组织特异性,除在乳腺表达外,仅在脾脏和小肠有一定的异位表达.结论成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器.
