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重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测
目的对铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列进行改造,以获得相对分子质量小、活性强的重组毒素PE38KDEL. 方法基于铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列的高GC含量,通过PCR反应和酶切技术,构建重组毒素PE38KDEL基因,并于大肠杆菌表达,用Western blot分析表达产物.为检测其生物活性,将其与靶向分子IL-4突变体cpIL4(13D)融合,构建融合蛋白表达载体,并于大肠杆菌表达,表达产物经亲和色谱和阴离子交换色谱纯化后,用MTT法检测其对表达IL-4受体的黑色素瘤细胞LiBr的细胞毒性. 结果成功构建了PE38KDEL基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,表达量占细胞全蛋白的21%左右;构建了融合蛋白cpIL4(13D)-PE38KDEL,并于大肠杆菌AD494(DE3)中得到高效表达,纯化后融合蛋白的纯度达95%以上,细胞毒实验证明其对黑色素瘤细胞LiBr具有良好的杀伤作用,这说明改造后的PE38KDEL是具有细胞毒效应的. 结论重组毒素PE38KDEL的构建,为各种导向药物的构建奠定了基础.
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联合IL-5可溶性受体与IL-4突变体对支气管哮喘小鼠气道高反应性及IgE、IFN-γ水平的影响
目的 通过观察IL-5可溶性受体(sIL-5Rα)及IL-4突变体(IL-4 mutant,IL-4MT)对哮喘小鼠气道高反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)及IgE、γ干扰素(IFN-γ)水平的影响,探讨其潜在的临床应用价值.方法 随机将50只BALB/c雌性小鼠分成5组,分别为正常对照组、哮喘组、IL-4MT治疗组、sIL-5Rα治疗组和IL-4MT联合sIL-5Rα治疗组(简称联合治疗组).采用腹腔注射卵蛋白(ovalbumin,OVA)与氢氧化铝混悬液对小鼠进行致敏,卵蛋白雾化,建立小鼠哮喘模型,其中正常对照组用生理盐水替代.雾化前30 min,IL-4MT治疗组、sIL-5Rα治疗组及联合治疗组分别腹腔注射IL-4MT 100 μg、sIL-5Rα 100 μg、IL-4MT和sIL-5Rα各100μg,正常对照组与哮喘组用生理盐水替代.末次激发24 h后,用不同浓度的氯化乙酰胆碱激发各组小鼠,测定其肺阻力,ELISA法观察比较各组血清及BALF IgE、IFN-γ水平变化,肺组织行HE染色,观察病理变化.结果 与正常对照组相比,哮喘组肺阻力显著增加(P＜0.01);与哮喘组相比,IL-4MT组和联合治疗组肺阻力显著降低(P＜0.05),联合治疗组下降更明显;与sIL-5Rα治疗组相比,联合治疗组肺阻力显著降低(P＜0.05).与正常对照组相比,哮喘组血清及BALF中IgE含量显著升高,IFN-γ含量显著下降(P＜0.01);与哮喘组相比,联合治疗组血清及BALF中IgE含量显著下降,IFN-γ含量显著升高(P＜0.01);与单独治疗组相比,联合治疗组血清及BALF中IgE含量显著下降,IFN-γ含量显著升高(P＜0.05).与哮喘组比,单独治疗组与联合治疗组肺组织炎症细胞渗出、浸润及对气道上皮的炎性损伤明显减轻,联合治疗组减轻更明显.结论 联合应用sIL-5Rα与IL-4MT可以明显减轻哮喘小鼠AHR,降低血清及BALF中IgE含量,同时升高IFN-γ含量,减轻气道炎症.
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联合应用IL-4突变体及抗IL-17抗体对支气管哮喘小鼠炎性细胞及细胞因子水平的影响
目的 探讨联合应用IL-4突变体及抗IL-17抗体对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠炎性细胞及细胞因子水平的影响.方法 40只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组、哮喘组、IL-4突变体治疗组、抗IL-17抗体治疗组、联合IL-4突变体及抗IL-17抗体治疗组(简称联合治疗组).哮喘组和治疗组用鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)和氢氧化铝致敏,用OVA激发,建立小鼠哮喘模型,对照组用生理盐水代替,其中IL-4突变体治疗组、抗IL-17抗体治疗组及联合治疗组分别于诱发前30 min给予腹腔注射相关抗体蛋白,对照组及哮喘组用生理盐水代替.细胞计数板测外周血炎性血细胞,酶联免疫吸附试验双抗体夹心法测定各组血清细胞因子水平变化.结果 与对照组比较,哮喘组炎性细胞数及IL 4、IL-17、IgE水平明显升高(P＜0.05);联合治疗组可有效降低炎性细胞计数及IL-4、IL-17、IgE水平,与哮喘组比较差异有统计学意义(P＜0.05);与单独治疗组相比,联合治疗组效果更明显(P＜0.05).结论 联合应用IL-4突变体及抗IL-17抗体对哮喘小鼠外周血炎性细胞有抑制作用,且可以降低IL-4、IL-17、IgE细胞因子水平,为治疗和缓解哮喘提供一定的帮助.
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联合 IL-4突变体及 IL-5可溶性受体α对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响
目的：观察联合应用 IL-4突变体(IL-4 MT)及 IL-5可溶性受体α(sIL-5Rα)对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道炎症水平的干预。方法50只雌性 BALB/c 小鼠随机分为正常对照组、哮喘组、IL-4 MT 治疗组、sIL-5Rα治疗组、联合 IL-4 MT 及 sIL-5Rα治疗组(简称联合治疗组)。哮喘组和治疗组分别给予卵蛋白(OVA)致敏和激发。其中,IL-4 MT 治疗组、sIL-5Rα治疗组、联合治疗组分别于激发前30 min 腹腔注射 IL-4 MT 100μg、sIL-5Rα100μg 及 IL-4 MT、sIL-5Rα各100μg 进行干预,正常对照组和哮喘组给予生理盐水代替。末次激发后收集 BALF 计数白细胞和嗜酸粒细胞(EOS)比例；HE 染色观察肺组织病理变化；ELISA 法测定各组 BALF 中 IL-4、IL-5、嗜酸粒细胞趋化因子(Eotaxin)水平变化；末端脱氧核苷酸转移酶介导的 d-UTP 切口末端标记(TUNEL)法检测肺组织 EOS 凋亡情况。结果与正常对照组比较,哮喘组小鼠肺组织出现典型病理损害,EOS 比例(t =-50.48,P <0.001)、IL-4(t =-12.98,P <0.001)、IL-5(t =-20.51,P <0.001)、Eotaxin(t =-17.56,P <0.001)水平均显著升高,EOS 凋亡率(t =5.35,P <0.001)显著下降；与哮喘组比较,各治疗组小鼠肺组织病理损害明显减轻,EOS 比例(IL-4 MT 治疗组 t =27.4,P <0.001；sIL-5Rα治疗组 t =29.41,P <0.001；联合治疗组 t =37.25,P <0.001)明显下降；Eotaxin(IL-4 MT 治疗组 t =6.92,P <0.001；sIL-5Rα治疗组 t =4.96,P <0.001；联合治疗组 t =9.95,P <0.001)水平明显下降；EOS 凋亡率(IL-4 MT 治疗组 t =-4.26,P <0.001；sIL-5Rα治疗组 t =-5.81,P <0.001；联合治疗组 t =-7.28,P <0.001)明显增高；与单独治疗组相比,联合治疗组对炎症的缓解效果更为明显。结论联合 IL-4 MT 及 sIL-5Rα可明显降低哮喘小鼠 IL-5、Eotaxin 水平,减少肺部 EOS 的浸润和增加其凋亡,可以明显缓解哮喘气道炎症。
关键词： 哮喘 IL-4突变体 IL-5可溶性受体α 嗜酸粒细胞 凋亡
