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结核分枝杆菌甲硫腺苷核苷酶的原核表达及活性分析
目的 克隆、表达、鉴定结核分枝杆菌(MTB) Rv0091基因编码蛋白,分析酶活性,初步鉴定其功能.方法 构建Rv0091基因原核表达质粒,在大肠杆菌BL21trxB进行表达,经IPTG诱导,Ni2+-NTA柱纯化后获得可溶性蛋白,通过SDS-PAGE分析目的蛋白纯度、Western blot进行免疫学活性鉴定、质谱分析重组蛋白相对分子质量、酶耦联法检测酶活性,分析酶学性质.结果 成功构建Rv0091基因原核表达质粒,建立了可溶性蛋白佳表达体系,获得纯度在95％以上的可溶性蛋白,Western blot结果证实重组蛋白为结核分枝杆菌蛋白,质谱鉴定其相对分子质量与理论值基本一致,酶学活性实验证实重组蛋白能够分解底物5′-甲硫腺苷(MTA),酶学性质分析表明适缓冲液为磷酸盐缓冲液和Hepes,酶的热稳定性较差,37℃为适反应温度,适pH为10 ～ 12.结论 初步证明该重组蛋白在体外能够分解MTA,发挥甲硫腺苷核苷酶(MTAN)的作用,可能在MTB的代谢中起关键作用.
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卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的测定及其临床意义
目的:探讨卵巢癌的发病机理及演变过程中的分子机制.方法:收集住院患者,并经病理检查确诊,分为三组.恶性卵巢肿瘤33例,其中上皮性腺癌27例,非上皮性6例.结果:33例恶性卵巢肿瘤中有27例端粒酶表达为阳性,阳性率为83%,4例良性肿瘤组织中,有1例为阳性,而13例正常卵巢组织中端粒酶表达均为阴性.结论:端粒酶活性的改变可作为卵巢恶性肿瘤的早期分子生物学标志.端粒酶活性的检测将有可能成为恶性肿瘤早期诊断的良好指标.
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人5α-还原酶Ⅱ在CHO细胞中的表达及活性鉴定
类固醇5α还原酶(SRD5A)催化睾酮(T)转化为二氢睾酮(DHT),DHT的升高可导致良性前列腺增生等疾病的发生,因此抑制SRD5A的活性将成为治疗该类疾病的重要途径.文章将5α还原酶Ⅱ(SRD5A2)基因克隆到pcDNA3载体,并转染至CHO细胞,经G418筛选后获得表达SRD5A2基因的CHO细胞系.应用新建立的表达SRD5A2的细胞系,检测了选择性和非选择性抑制剂对SRD5A2的抑制效应,结果表明外源性SRD5A2显示很高的酶活性,而且这种活性能被其特异抑制剂非那雄胺所抑制.这一结果不仅确证了人类固醇5α还原酶Ⅱ型在CHO细胞的表达和产物活性,同时也为该类抑制剂的体外筛选提供了一种简便可靠的方法.
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泛素特异性蛋白酶2a的原核表达纯化及酶活性分析
目的 为了探讨泛素特异性蛋白酶2a(USP2a)在肿瘤发生发展中的催化机制,构建USP2a C末端催化结构域原核表达质粒pET28a-USP2a-C,分析USP2a C末端催化结构域的活性情况.方法 利用荧光检测方法测定USP2a-C的酶促动力常数,并采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/ MS)分析USP2a的肽酶和异肽酶活性.结果 结果表明获得了可溶性表达的USP2a-C融合蛋白,酶促动力学分析 USP2a-C 水解底物 Ub-AMC 的催化效率 Kcat/Km =2. 53 × 105 mol/(L · s);LC-MS/MS分析结果表明USP2a-C能有效分解 Di-Ub和Ub-V77两种不同性质的底物,并且两者之间的催化活性差异无统计学意义.结论 获得了可溶性表达的 USP2a-C蛋白,并且分析证明其具有完整的去泛素化酶的活性.
关键词： 泛素特异性蛋白酶2 酶活性分析 液相色谱-质谱联用技术 -
制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究
目的 研究制半夏对基质金属蛋白酶-16(MMP-16)活性的抑制作用.方法 根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理,通过检测底物降解速率,测定中药制半夏对MMP-16的抑制作用.结果 与空白对照组及阳性对照组相比,制半夏具有较强的抑制MMP-16活性的作用,其抑制活性IC50=23μg/ml.结论 半夏水煎剂在体外具有抑制MMP-16活性的作用,其抑制活性较强,且存在剂量依赖关系.
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具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV-NS3重组蛋白的纯化及活性分析
为深入探讨HCV-NS3蛋白的酶动力学性质,制备了具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV NS3重组蛋白.利用PCR扩增HCV非结构基因NS3,插入pPIC9,测序分析.携带NS3基因的重组质粒(pPIC9-NS3)转化毕氏酵母菌菌株GS115,甲醇诱导表达NS3蛋白.重组蛋白首先采用Hitrap chelating柱进行亲和分离,之后使用Mono S HR柱进一步纯化.对纯化后的NS3重组蛋白的酶活性进行分析,结果表明,获得的重组蛋白分别具有蛋白酶及解旋酶活性.本研究为深入探讨NS3编码酶的功能和开发抗病毒药物创造条件.
