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细菌性阴道病与微生态平衡
细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)是妇科常见病、多发病.细菌性阴道病曾有过许多名称,如嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌性阴道炎、加德纳菌性阴道炎及非特异性阴道炎等.直到1984年在瑞典的专题国际会议上才正式命名其为细菌性阴道病.细菌性阴道病名称的界定,首先是因为阴道内有大量细菌生长繁殖,主要有加德纳菌、动弯杆菌、普雷沃菌、紫单胞菌、类杆菌、消化链球菌等,且以厌氧菌为主.然而,至今无法确定引起BV的特异性细菌,故笼统地称之为"细菌性".尽管患BV时,阴道内有大量的细菌生长及分泌物增加症状,却没有临床阴道炎时所表现出的阴道黏膜的炎症症状,故称之为阴道病而不称为阴道炎.因此,该病被命名为细菌性阴道病.
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基于比较蛋白质组学技术的牙髓卟啉单胞菌毒力因子分析
目的 分析牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,Pe)和不同毒力牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)表达量相近的蛋白,筛选Pe潜在的毒力因子.方法 将Pe ATCC35406分别与Pg高毒力株PgW83、低毒力株Pg ATCC33277进行全细胞蛋白质组学比较,采用相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)与纳升液相色谱串联质谱(nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry,Nano-LC-MS/MS)相结合的比较蛋白质组学技术,通过同位素标记肽段、质谱检测和生物信息学分析等方法,分析Pe ATCC35406分别与PgW83、Pg ATCC33277之间表达相近的蛋白数及蛋白的生物学功能.结果 Pe ATCC35406和Pg W83比较时共鉴定到l 210个蛋白,其中表达量相近的蛋白130个(占蛋白总数的10.74％),包括89个功能蛋白和41个未知功能蛋白;Pe ATCC35406和Pg ATCC33277比较时共鉴定到1 223个蛋白,其中表达量相近的蛋白110个(占蛋白总数的8.99％),包括72个功能蛋白和38个未知功能蛋白.Pe ATCC35406与不同毒力的Pg表达相近的蛋白集中在外膜蛋白和蛋白酶,包括有致病作用的重组活化基因A(recombination activation geneA,RagA)、脂蛋白、伴侣蛋白Dnak、Clp家族蛋白(ClpC和ClpX)以及多种铁结合蛋白等,主要行使催化活性和结合功能,参与代谢和细胞进程.Pe ATCC35406与Pg W83表达相近的毒力蛋白种类和数目相对多于与低毒力Pg ATCC33277表达相近的蛋白.结论 脂蛋白、氧气耐受蛋白、铁结合蛋白等可能为Pe ATCC35406潜在的毒力因子,Pe的致病能力与高毒力Pg更接近.
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伴糖尿病牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌FimA基因型的检测
目的 了解伴2型糖尿病牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白A(fimbria protein A,FimA)基因型的分布情况,探讨糖尿病加重牙周破坏的可能机制.方法 纳入北京大学口腔医学院·口腔医院牙周科中老年中重度牙周炎患者80例,其中伴2型糖尿病40例(伴糖尿病牙周炎组),无系统性疾病者40例(单纯牙周炎组).对两组患者分别进行问卷调查、全口牙周检查及血生化检查,滤纸条法取前牙和后牙各一个位点的龈下菌斑形成集合菌斑样本,PCR法检测样本内Pg及其FimA基因型,比较两组受试者Pg及其FimA基因型的检出差异.结果 伴糖尿病牙周炎组菌斑指数[2.35(0.58)]显著高于单纯牙周炎组[1.64(0.76)](P＜0.05),其他各项牙周临床指标差异均无统计学意义(P＞0.05);伴糖尿病牙周炎组龈下菌斑Pg检出率[50％(20/40)]与单纯牙周炎组[60％ (24/40)]相比差异无统计学意义(P＞0.05),但FimAⅡ型检出百分比[80％(16/20)]显著高于后者[42％(10/24)] (P＜0.05).结论 伴2型糖尿病牙周炎患者较无系统性疾病牙周炎患者更易感染毒力较强的FimA Ⅱ型Pg.
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钛种植体载抗菌肽涂层的抗菌性及其对成骨细胞活性的影响
目的 探讨钛种植体表面载抗菌肽涂层对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性及其对成骨细胞黏附、增殖的影响,为构建具有抗菌功能及良好生物活性的口腔种植体功能性生物涂层提供依据.方法 纯钛试件经超声微弧氧化、碱处理、硅烷化处理后,分别加入0.25、0.50、0.75g/L抗菌肽Pac-525得到3组抗菌肽组试件,对照组钛试件仅进行超声微弧氧化、碱处理和硅烷化处理(每组样本量均为45).用扫描电镜及能谱分析仪观察各组涂层形貌并分析元素变化,吖定橙-溴化乙锭双染色检测各组试件与牙龈卟啉单胞菌共培养72 h后的活菌平均百分比和生物膜厚度,细胞计数试剂盒检测成骨细胞增殖情况,免疫荧光染色观察成骨细胞黏附数量及生长形态.结果 扫描电镜观察可见抗菌肽颗粒嵌入涂层表面的微孔中,各抗菌肽组C、N元素均明显多于对照组;对照组、0.25、0.50、0.75 g/L抗菌肽组的活菌平均百分比分别为0.58％、0.45％、0.34％和0.28％,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).0.50和0.75 g/L抗菌肽组牙龈卟啉单胞菌的生物膜厚度[分别为(98.3±1.2)和(94.5±2.5)μm]均显著小于对照组和0.25 g/L抗菌肽组[分别为(117.6±1.5)和(118.0±1.3)μm](P＜0.05);各抗菌肽组成骨细胞的黏附和增殖数量均显著大于对照组(P＜0.05),且细胞铺展较好.结论 钛种植体载抗菌肽涂层可阻碍细菌生物膜生成,有较好的抗菌性且具有促进成骨细胞黏附及增殖的作用.
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原发性根尖周炎感染根管内牙龈卟啉单胞菌fimA与kgp基因型组合的研究
目的 探寻原发性根尖周炎感染根管内牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg) fimA与kgp基因多态性分布及常见的基因型组合,为筛选Pg毒力株提供依据.方法 从上海交通大学医学院附属第九人民医院牙体牙髓科2013年6月至2015年9月间采集的原发性根尖周炎感染根管样本中筛选34例Pg阳性样本,利用专性引物进行fimA基因扩增分型,同时采用MseⅠ内切酶进行kgp酶切分型.统计fimA与kgp各基因型检出率与常见基因型组合,并通过Pearson χ2检验法分析基因型组合与临床症状的相关性.运用激光扫描共聚焦显微镜观察比较携带不同基因型组合的Pg生物膜结构差异.结果34例Pg阳性样本中,fimAⅡ型检出率高[47%(16/34)],其次为fimAⅠ型[26%(9/34)], fimAⅤ型仅检出1例,kgpⅠ型的检出率[56%(19/34)]略高于Ⅱ型[44%(15/34)].其中,fimAⅡ型+kgpⅠ型和fimAⅡ型+kgpⅡ型是常见的2种基因型组合,检出率均为24%(8/34).特定基因型组合的检出与牙龈肿胀、牙源性窦道无显著相关性(P>0.05).从样本中分离获得3株携带不同基因型组合的Pg,其分离株A(fimAⅠ型+kgpⅠ型)形成的生物膜致密,分离株C(fimAⅤ型+kgpⅠ型)形成的生物膜较疏松,分离株B(fimAⅢ型+kgpⅡ型)介于两者之间.结论 原发性根尖周炎感染根管内Pg以fimAⅡ型为主,kgpⅠ型略多于kgpⅡ型,fimAⅡ型+kgpⅠ型与fimAⅡ型+kgpⅡ型是常见的两种基因型组合;不同基因型组合可能导致Pg生物膜结构存在差异.
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牙龈卟啉单胞菌菌毛致病机制的研究进展
FimA蛋白是牙龈卟啉单胞菌的重要毒力因子,在牙龈卟啉单胞菌黏附和入侵宿主细胞,促进牙菌斑生物膜形成以及引起宿主免疫炎症反应的过程中发挥重要作用,与牙周病和心血管疾病的发生和发展密切相关.根据编码FimA蛋白的fimA基因核苷酸序列的不同可将牙龈卟啉单胞菌分为Ⅰ、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型共6种基因型.FimA的表达受fimA基因的调控,不同fimA基因型菌毛的致病作用有一定差异.本文就牙龈卟啉单胞菌菌毛相关致病机制的研究进展进行综述.
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牙龈卟啉单胞菌超声提取物对小鼠成骨细胞骨向分化蛋白表达的影响
目的 研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)W83超声提取物对小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1)骨向分化相关蛋白表达的影响,探讨Pg超声提取物对细胞成骨功能的作用.方法 标准厌氧环境下培养PgW83,收集细菌沉淀,离心后制备细菌的超声提取物,然后以0(对照组)、10、100及1000 mg/L的质量浓度加入MC3T3-E1的成骨诱导分化培养基中,培养14 d后提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测细胞骨钙蛋白、骨涎蛋白、骨桥蛋白及骨粘连蛋白的表达改变,酶标仪法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达；培养21 d后茜素红染色观察MC3T3-E1矿化结节形成情况；以上实验均重复3次,应用SPSS 13.0统计软件对各组结果进行单因素方差分析,检验水准为双侧α =0.05.结果 Pg超声提取物作用于MC3T3E1 14 d后,100 mg/L实验组细胞表达骨粘连蛋白、骨钙蛋白的相对表达量(分别为0.141±0.023、0.625±0.451)均显著低于对照组(均为1.000 ±0.000)和10 mg/L组(分别为1.035 ±0.133、0.852±0.110)；1000 mg/L组细胞表达骨粘连蛋白、骨钙蛋白的相对表达量(分别为0.020±0.003、0.213±0.053)均显著低于对照组、10及100 mg/L组(P＜0.05),Pg超声提取物呈剂量依赖性显著下调骨粘连蛋白和骨钙蛋白的表达.1000 mg/L高浓度时,Pg超声提取物显著下调骨桥蛋白的表达(蛋白相对表达量为0.572±0.162),与对照组、10及100 mg/L实验组相比骨桥蛋白表达(分别为1.000±0.000、1.029±0.135、1.199±0.337)差异均有统计学意义(P＜0.05).Pg超声提取物不改变骨涎蛋白的表达,对照组、10、100及1000 mg/L组间骨涎蛋白的相对表达量(分别为1.000 ±0.000、0.831±0.182、0.897±0.115、0.778±0.235)差异无统计学意义(P＞0.05).Pg超声提取物抑制MC3T3-E1的ALP活性,其抑制作用随各实验组质量浓度的增加逐渐增强,10、100、1000 mg/L质量浓度组ALP活性[分别为(0.0140±0.0011)、(0.0057±0.0013)及(0.0020±0.0008) U/gprot]均显著低于对照组[(0.0275±0.0014) U/gprot](P＜0.05),同时Pg超声提取物作用于MC3T3-E1 21d后能明显抑制MC3T3-E1矿化结节的形成.结论 Pg超声提取物可以下调小鼠成骨细胞骨向分化蛋白的表达,抑制细胞的成骨功能.
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抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白的制备、鉴定及理化特性分析
目的 制备牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的卵黄免疫球蛋白( immunoglobulin yolk,IgY)并评价其理化性质,以期为采用被动免疫抗体防治慢性牙周炎寻找新途径.方法 厌氧培养Pg国际标准菌株ATCC33277,收集细菌,超声振荡至菌体完全破碎,离心,收集上清液,即为全菌可溶性蛋白抗原.罗曼母鸡隔离饲养至5个月龄用于抗体的制备.以质量浓度为1 g/LPg全菌可溶性蛋白抗原1ml与等量弗氏完全佐剂吹打混匀成油包水状注射剂,经皮下和肌肉多点注射免疫母鸡,共注射免疫4次,每次免疫间隔时间为10d.初次免疫即开始收集鸡蛋,标记后4℃保存.提纯免疫后不同时间的抗Pg-IgY,二喹啉甲酸总蛋白定量法测定蛋白浓度,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定,间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法进行IgY 抗体效价变化和理化性质的检测.结果 通过免疫诱导出质量浓度为2.05 g/L的特异性IgY,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得相对分子质量分别为65000的重链和25000的轻链,与理论值一致；间接ELISA法结果显示初次免疫后5d左右出现抗Pg-IgY,免疫后50～55d达峰值；抗体效价达到1∶100000以上；一个鸡蛋可以生产超过10 mg的IgY,纯度高达95％.结论 Pg全菌蛋白免疫产蛋母鸡可使鸡蛋产生高效价、高浓度的特异性IgY,该抗体纯度高、耐热、耐酸碱,理化性质稳定,适合口腔环境.
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牙龈卟啉单胞菌影响血管内皮细胞增殖和凋亡的实验研究
目的 观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivatis,Pg)对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发病机制中的作用.方法 建立体外Pg侵入血管内皮细胞模型,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察细胞增殖,碘化丙啶染色、流式细胞仪分析细胞周期,Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡.结果 PgATCC33277侵入后72 h细胞增殖活性降低12.46%,Pg W83侵入后72 h细胞增殖活性降低10.47%(F=786.68,P<0.01);Pg W83侵入后24 h使G1期细胞增加(F=43.23,P<0.01),ATCC 33277侵入后48 h使G1期细胞增加(F=66.72,P<0.01);Pg侵入后24 h即诱导细胞凋亡(F=1074.56,P<0.01).结论 Pg可能通过细胞毒性及诱导凋亡作用,加重血管内皮细胞的局部炎性反应,在动脉粥样硬化炎性病理反应中有重要意义.
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牙龈卟啉菌蛋白酶R重组表达产物在牙周炎中的作用
目的 构建蛋白酶R基因原核表达系统,初步探讨蛋白酶R( gingipain R,Rgp)与慢性牙周炎的关系.方法 构建Rgp原核表达系统,以重组表达的rRgp作用于人单核细胞THP-1株,用流式细胞术检测细胞膜表面CD-14表达的变化,并用酶联免疫吸附测定检测细胞分泌白细胞介素(IL)-1β水平的变化.结果 扩增的Rgp基因与已报道的基因序列进行比较,核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均＞97％.THP-1细胞表达CD-14的平均荧光强度为68.97,rRgpAcat或rRgpB作用于THP-1细胞0.5h后,CD-14的平均荧光强度分别减少到45.30、46.47,差异有统计学意义(P＜0.05),rRgp对THP-1细胞分泌IL-1β的水平也有明显的阻断作用(P＜0.01).结论 成功构建了Rgp基因原核表达系统,rRgp蛋白酶能够降解CD-14,阻断THP-1细胞炎症因子的分泌,从而可能延缓炎症的进程,导致炎症的慢性化.
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肝配蛋白B2在牙龈卟啉单胞菌诱导单核细胞黏附人脐静脉内皮细胞中的作用
目的 检测肝配蛋白B2 (erythropoietin producing hepatomocellular receptor interacting protein B2,Ephrin B2)及其受体在单核细胞THP-1黏附人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中的作用,揭示牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)感染增强THP-1黏附HUVEC的分子机制.方法 应用厌氧罐培养Pg,以感染复数1∶100感染人单核细胞株THP-1,感染8和24 h后,收集部分样品分别用于检测THP-1细胞Ephrin B2及其受体表达水平的变化;其余样品与转染空载体或过表达Ephrin B2的HUVEC细胞共培养,用实时荧光定量和蛋白质印迹法检测HUVEC细胞Ephrin B2的表达水平,并观察Ephrin B2对THP-1与HUVEC黏附的影响.结果 Pg感染24 h后,THP-1细胞Ephrin B2受体EphB3、EphB4和EphA4的mRNA表达水平分别提高至5.169±0.152、11.040± 1.195和4.976±0.122,与未感染对照组(结果数据为1)相比差异均有统计学意义(P＜0.01);与经Pg感染的THP-1共培养后,HUVEC细胞Ephrin B2的表达提高至8.938±0.962,与未感染对照组相比差异均有统计学意义(P=0.008);不经过感染,HUVEC直接过表达Ephrin B2后,THP-1对HUVEC黏附性显著增加.结论 感染Pg的THP-1黏附HUVEC的数量增多与Ephrin B2及其受体的相互作用有关,提示动脉血管内皮细胞特异性表达的Ephrin B2分子参与动脉粥样硬化的发生.
关键词： 紫单胞菌 龈 单核细胞 内皮细胞 促红细胞生成素产生的肝细胞受体-肝配蛋白B2 -
牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究
目的 比较牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因.方法 采用抑制消减杂交技术(SHH)对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异.以高毒力株W83为被检菌, 低毒力株ATCC 33277为参考菌,将提取的基因组DNA用内切酶RsaⅠ酶切,连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增,得到消减混合物,与TA克隆载体连接,转化到JM109中,建立消减文库,经PCR筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析.结果 经SSH筛选鉴定得到36 个片段大小为88～372 bp 的阳性克隆基因片段.结论 从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异,为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据.
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人单核细胞株THP-1前列腺素E2合成通路的影响
目的 探讨牙龈卟啉单胞菌脂多糖(1ipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS)在诱导细胞前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成通路上是否具有不同于大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide of Escherichia coli,Ec-LPS)的特点.方法 用Pg-LPS和Ec-LPS分别作用于人单核细胞株THP-1,用酶免疫法检测PGE2的浓度.用液闪计数法观察花生四烯酸释放水平的变化.用反转录聚合酶链反应和Western blotting法分别检测胞质磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)、环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和微粒体前列腺素E合成酶1(microsomal prostaglandinE synthase-1,mPGES-1)的mRNA和蛋白表达水平.结果 Pg-LPS诱导PGE:合成和释放花生四烯酸的水平明显弱于Ec-LPS(P<0.05).PGE2水平增高在Pg-LPS作用6 h出现,24 h达峰值,为(221.40±29.46)rig/L;或Ec-LPS作用1～48 h,为(161.80±17.31)一(379.80±37.35)ng/L.COX-2和mPGES-1的高表达出现在Pg-LPS作用16 h,或Ec-LPS作用8 h和16 h时.cPLA2的抑制剂AACOCF3町降低LPs诱导的花生四烯酸释放水平的增高,但对PGE2的合成无明显作用.COX-2阻断剂NS-398可显著减少PGE2产生.结论 Pg-LPS对PGE2合成通路的作用弱于Ec-LPS.Pg-LPS作用下PGE2的合成卡要是COX-2和mPGES-1表达增高所致,与cPLA2关系不大.
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖对泡沫细胞凋亡基因的影响
目的 了解牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipopmtein,oxLDL)形成泡沫细胞过程中和形成后对凋亡基因的影响,以期了解Pg影响动脉粥样硬化的可能机制.方法 以oxLDL、oxLDL+Pg-LPS刺激人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1源性巨噬细胞,以及oxLDL诱导巨噬细胞形成的泡沫细胞.采用吖啶橙-溴化乙锭双染色观察细胞凋亡,聚合酶链反应(PCR)芯片检测11种动脉粥样硬化相关凋亡基因的变化,实时PCR检测p53、c-Myc和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3基因的变化.结果 Pg-LPS提高了巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞过程中和形成后的细胞凋亡率,分别为(5.47±0.93)%、(7.50 4-0.54)%;PCR芯片检测显示泡沫细胞形成过程中Pg-LPS上调了B细胞淋巴瘤-白血病-2相关蛋白Al的转录(>2倍),泡沫细胞形成后上调了B细胞淋巴瘤-白血病-2和B细胞淋巴瘤-白血病-2相关蛋白A1的转录(>2倍);在泡沫细胞形成过程中提高了p53和caspase-3的转录水平[分别为(4.50×10-3±4.02×10-4)和(5.30×10-2±4.58×10-3)],抑制了c-Myc的转录水平(1.53×10-2±5.77×10-4);在泡沫细胞形成后降低了p53转录水平(4.23×10-3±5.85×10-4),促进了caspase-3的转录水平(6.00×10-2±6.08×10-3),P<0.05.结论 Pg-LPS影响了泡沫细胞形成过程中和形成后细胞中多种凋亡基因的转录,促进了凋亡的发生.
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牙龈卟啉单胞菌不同菌株多糖诱导THP-1细胞分泌细胞因子的比较分析
目的 比较具有不同毒力特性的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)临床菌株的多糖成分诱导人单核细胞系THP-1细胞分泌白细胞介素(interleukin,IL)Ip、IL-8和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的能力,分析Pg多糖成分的免疫原性,探讨Pg的毒力相关因素.方法 酚-水提取法提取Pg高毒力标准菌株W83、高毒力临床菌株SJD2和SJD12(高毒株组)、低毒力标准菌株ATCC33277及低毒力临床菌株SJD4、SJD5和SJD11(低毒株组)的多糖成分,并作用于人单核细胞系THP-1细胞,利用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测在10％和1％胎牛血清环境中,不同刺激物浓度、不同刺激时间下细胞上清液中IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度.结果 酚-水提取法获得各菌株多糖成分,经鉴定主要含有脂多糖及荚膜多糖成分.在含10％胎牛血清培养基中,各菌株多糖提取物诱导THP-1细胞分泌IL-1β、IL-8和TNF-α均呈时间、剂量依赖性;在含1％胎牛血清的培养基中,高毒株组IL-1β[4 h:(1 639 ±497) μg/L]、IL-8[4 h:(1 648 ±513) μg/L]及TNF-α的质量浓度[4 h:(140 ±48)μg/L]均显著高于低毒株组[4h时IL-1β、IL-8及TNF-α质量浓度分别为(773 ±382)、(892 ±400)及(67±33) μg/L].结论 Pg多糖提取物具有免疫原性,可以诱导THP-1细胞分泌IL-1β、IL-8和TNF-α;各菌株诱导THP-1细胞表达细胞因子的能力可能与其毒力密切相关.
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不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞产生血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的影响
目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)产生血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发生、发展中的可能作用.方法 实验分别以PgATCC33277 (Ⅰ fimA ) 、WCSP115 (Ⅱ fimA)、W83 (Ⅳ fimA)和大肠杆菌脂多糖刺激HUVEC作为T1、T2、T3组(3个实验组)和阳性对照组,未受刺激的HUVEC作为阴性对照组;标准条件下厌氧培养上述3型Pg,将其以及大肠杆菌脂多糖分别与 HUVEC共同孵育2、6、24 h,采用流式细胞术检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达量,并通过激光共聚焦显微镜观察ICAM-1和VCAM-1的表达分布情况.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后,细胞表面ICAM-1表达均增强(P<0.05),2、6、24 h表达量分别为Ⅰ fimA:60.27±5.43、80.81±1.44、85.94±2.56;Ⅱ fimA:86.69±8.81、90.19±0.00、96.18±0.48,Ⅳ fimA:59.66±0.40、85.79±4.86、96.04±2.07.除2 h时ⅠfimA与Ⅳ fimA型Pg刺激的HUVEC表面ICAM-1表达量差异无统计学意义外,其他各时间点Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg的刺激作用均强于Ⅰ fimA型Pg(P<0.05).本研究条件下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后2、6、24 h表达VCAM-1的水平均较低,各实验组与对照组间相比差异均无统计学意义(P>0.05).激光共聚焦显微镜观察显示,Pg刺激下HUVEC表达ICAM-1和VCAM-1增加,在Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激下,HUVEC中ICAM-1和VCAM-1荧光点相对较多且分布范围广.结论 牙周主要致病菌Pg毒力和致病性与其fimA基因型相关,Ⅱ fimA和Ⅳ fimA型Pg 有较强的上调HUVEC表达细胞黏附分子的能力,可能导致血管内皮功能紊乱.
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牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K-caspase样亚基的表达与青春期龈炎的临床相关性
目的 检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(gingipain K,Kgp)-caspase样亚基的表达强度及酶活性,揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系.方法 检测并记录36例14～17岁的青春期龈炎患者的牙龈指数、龈沟出血指数及探诊深度,取龈下菌斑进行Pg的分离培养,16S rRNA PCR法鉴定.将获得的10个Pg临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,测定其酶活性,并用Kgp-caspase样亚基的单克隆抗体进行Western blot检测.Kgp的表达强度及酶活性与各牙周指数之间的相关关系用等级相关系数.结果 青春期龈炎的Pg临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中,Kgpcaspase样亚基的表达强度及酶活性与各牙周指数的大小呈正相关关系,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 青春期龈炎龈下菌斑中Pg的Kgp十分复杂,存在表现为低相对分子质量形式的caspase样活性分子,这些细胞内功能蛋白分子将影响Pg和宿主问的相互作用;Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用.
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖对单核细胞THP-1表达CC类趋化因子受体2的影响
目的 研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysacchearide,Pg-LPS)对单核细胞THP-1表达CC类趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2,CCR2)的影响,从分子水平探讨牙周炎与心血管疾病之间的关系.方法 采用不同质量浓度[0 μg/L(空白对照组)、10 μg/L(T1组)、100 μg/L(T2组)、1000μg/L(T3组)]Pg-LPS处理THP-1细胞1、4和24 h,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测THP-1表达CCR2蛋白和mRNA的变化.结果 除1h的T1组CCR2受体蛋白表达量(55.74 ±0.96)外,所有实验组不同时间点CCR2的蛋白和mRNA表达水平均显著高于空白对照组(P ＜0.05)；24 h时T1 ～ T3组CCR2的蛋白表达量(52.56±0.61、40.98±0.86、26.50±0.67)和mRNA表达量(0.095±0.006、0.070±0.004、0.046±0.004)均显著低于空白对照组CCR2蛋白和mRNA表达(56.99±0.44、0.104 ±0.003),差异均有统计学意义(P＜0.05)；所有实验组CCR2蛋白和mRNA表达水平均在4h时增加,24 h时降低,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Pg-LPS作用于单核细胞的早期阶段,可呈浓度依赖性刺激单核细胞表面CCR2受体的表达,促进单核细胞的趋化作用；牙周致病菌导致的单核细胞趋化作用增强可能是牙周炎促进动脉粥样硬化斑块形成的原因之一.
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唾液富组蛋白5抑制牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌共聚的初步研究
目的 研究唾液富组蛋白5抑制牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌共聚的能力并进行初步的机制分析,以期揭示富组蛋白5在抑制慢性牙周炎发生过程中的作用.方法 收集49例就诊于中国医科大学口腔医学院牙周科的慢性牙周炎患者(慢性牙周炎组)和27名牙周健康者(牙周健康组)的唾液及龈上、龈下菌斑,采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测唾液中富组蛋白5的含量,实时荧光定量PCR(绝对定量)检测龈上、龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)和总细菌的DNA拷贝数;采用黏附实验和扫描电镜分别检测25 mg/L富组蛋白5对Pg-Pg、Pg-Fn共聚的影响;实时荧光定量PCR(相对定量)技术检测25 mg/L富组蛋白5对Pg血凝素基因、精氨酸牙龈素基因及Fn FomA基因表达的影响.实验组(加入25 mg/L富组蛋白5)与对照组(未加入富组蛋白5)之间差异的比较采用独立样本t检验,以双侧P<0.05为差异有统计学意义.结果 慢性牙周炎组唾液富组蛋白5与龈上菌斑中Fn、Pg均呈负相关关系(r=-0.379, r=-0.624);与龈下菌斑中的Fn、Pg也均呈负相关关系(r=-0.404,r=-0.314).牙周健康组富组蛋白5仅与龈上、龈下菌斑中的Pg呈负相关关系(r=-0.572,r=-0.533).25 mg/L的富组蛋白5能抑制Pg-Pg及Pg-Fn的共聚;实时荧光定量PCR(相对定量)结果显示,唾液富组蛋白5使Pg血凝素基因表达升高(14.52±3.25)倍,使Fn FomA基因表达下降至原来的(0.22±0.10).结论 唾液富组蛋白5可能通过调节Pg血凝素基因、Fn FomA基因的表达抑制Pg-Pg和Pg-Fn的共聚.
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长春市某小学7～12岁儿童牙周致病菌分布状态调查
目的 应用聚合酶链反应(PCR)法对儿童口腔内牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)分布状态进行检测,探讨检出结果与牙周临床指标之间的关系.方法 选取长春市自强小学151名7至12岁儿童为研究对象,选择右上颌中切牙唇面和右上颌第一磨牙颊面为被检部位,取龈上菌斑、记录探诊出血(bleeding on probing,BOP)、探诊深度(probing depth,PD)、牙龈指数(gingival index,GI),应用PCR法对两菌种进行检测.结果 ①儿童龈上菌斑中Pg、Aa检出率为27.6%、54.3%;②6颊面Pg、Aa的检出率(40.0%、57.9%)均高于1 唇面(15.5%、50.7%),Pg检出率差异有统计学意义(P<0.01),且与BOP、PD、GI呈正相关;③Pg检出率随年龄增长呈逐渐增高趋势,Aa检出率在11～12岁组高,其次为7～8岁组和9～10岁组;④BOP阳性部位Pg、Aa检出率(38.3%、65.4%)均高于BOP阴性部位(23.2%、50.5%),P<0.05.在BOP阳性部位,随PD加深Pg检出率逐渐增高,特别是在PD≥4mm时,Pg检出率明显增高(P<0.05),显示Pg检出率与BOP阳性、PD增加呈正相关.结论 7～12岁儿童龈上菌斑中高频度分布着Pg、Aa;上颌前牙区与磨牙区菌丛构成不同,Pg在磨牙区定植更早;两菌种检出率随年龄增长而增加,且与牙周临床指标密切相关,儿童早期采取牙周病的预防措施是非常必要的.
