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XBP1s 条件性过表达定点敲入小鼠模型的建立
目的：获得可进行条件性过表达 XBP1s 基因的 Rosa 26定点敲入杂合子小鼠。方法通过 In-Fusion Cloning 的方法构建胚胎干细胞（ES 细胞）打靶载体，并进行线性化，电转染 JM8A3 ES细胞。药物筛选获得抗性 ES 细胞克隆，经长片段 PCR 鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性 ES细胞经克隆扩增后，注射入 C57BL／6J 小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠，筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL／6J 小鼠交配后获得阳性 F1代小鼠，并分别进行 PCR 和测序鉴定。结果经酶切鉴定证明打靶质粒构建成功，经胚胎干细胞打靶共获得144个抗性 ES 细胞克隆，通过长片段 PCR 的方式对同源重组阳性克隆进行筛选和克隆经测序确认，共获得21个正确同源重组的阳性克隆。阳性 ES 细胞克隆 E3、C6经扩增后注射 C57BL／6J 小鼠囊胚96个，通过胚胎移植，共获得2只高嵌合雄鼠，与野生型C57BL／6J 小鼠交配后获得3只 F1代杂合小鼠，经 PCR 及测序鉴定正确。结论成功建立了 XBP1s基因的 Rosa26定点敲入 F1代杂合子小鼠，为未来获得免疫细胞、肾脏固有细胞及腹膜间皮细胞XBP1s 条件性敲入小鼠奠定了基础。
关键词： XBP1s 非折叠蛋白反应/内质网应激 同源重组 基因打靶 条件性基因敲入 -
基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立
目的 构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲人人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究.方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导人C57BL/6 J小鼠囊胚,移人同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠.再将杂合予hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasn/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EⅡa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EⅡa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平.结果 成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率＞50％的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasf1/n小鼠与Tg (EⅡa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达.结论 成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EⅡa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲人小鼠模型做好技术储备.
关键词： 条件性基因敲入 HRAS基因 Cre-loxp系统 癌症
