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Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定
本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础.将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild.提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小.取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白.结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠.结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠.
关键词： Blimp-1 prdm1 基因敲除 Cre-loxp系统 -
基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立
目的 构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲人人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究.方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导人C57BL/6 J小鼠囊胚,移人同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠.再将杂合予hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasn/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EⅡa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EⅡa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平.结果 成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率＞50％的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasf1/n小鼠与Tg (EⅡa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达.结论 成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EⅡa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲人小鼠模型做好技术储备.
关键词： 条件性基因敲入 HRAS基因 Cre-loxp系统 癌症 -
精细突变小鼠模型的研究进展
基因打靶研究重要的应用之一是研制人类疾病动物模型.人类的疾病许多是由于基因功能丧失引起的,也有许多是由于基因超表达或功能获取(gainoffunction)引起的.后者的情况就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型.因此研究者发明了各种可以将诸如插入终止蜜码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法.早期的研究者采用的方法主要有两种,一是将不含选择标记基因的打靶载体直接经显微注射法引入ES细胞,然后用PCR分析鉴定同源重组克隆[1];另一种是用带有精细突变但无选择标记基因的打靶载体与仅含标记基因的载体经电穿孔共转染ES细胞[2].这两种方法在技术上有很大局限性,现在基本上已不再使用.目前较为常用的方法主要有"Hit and Run"、"Tag and Exchange"以及基于重组酶系统的方法[3].
关键词： 突变小鼠模型 Hit和Run法 双置换法 标记和置换法 Cre-loxp系统 -
Cre-loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用
Cre-loxp系统是近年来广泛应用在各领域的重组酶系统.该系统由组织特异性重组酶cre和loxp位点组成.可以通过对特定的DNA序列进行准确的切割及连接,达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的.牙釉质的发育离不开各种转录因子的作用,利用该系统对各转录因子的缺失或突变的研究,探讨特定时间、特定部位目的基因的异常改变对牙釉质发育的影响.
关键词： Cre-loxp系统 loxp位点 重组酶cre 转录因子 -
Gcm2基因敲除诱导成体小鼠甲状旁腺功能减退
目的 通过敲除成体小鼠Glial cells missing 2(Gcm2)基因,初步探索该基因在成体小鼠甲状旁腺功能减退症发病过程中的作用.方法 他莫昔芬诱导Gcm2E2fl/fl Cre-ER成体小鼠Gcm2基因条件性敲除,PCR鉴定敲除小鼠基因型,蛋白质印迹法检测甲状旁腺Gcm2蛋白的表达,钙磷测定试剂盒和ELISA法分别检测血清钙磷和甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)浓度变化,Ki-67免疫组化检测甲状旁腺细胞的增殖变化情况,Real-time PCR检测甲状旁腺PTH、钙敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)基因mRNA的表达,micro CT检测骨量变化.结果 PCR检测甲状旁腺组织基因组DNA呈Gcm2基因敲除型;与野生型对照组和Gcm2E2fl/fl Cre-ER小鼠溶剂对照组相比,Gcm2敲除组小鼠甲状旁腺Gcm2的蛋白表达明显下调(均P<0.01),血磷明显升高(均P<0.01),血钙和PTH浓度明显降低(均P<0.01),甲状旁腺细胞增殖明显增加(均P<0.01),甲状旁腺中PTH和CaSR的mRNA表达明显下调(均P<0.01).结论 Gcm2基因的可诱导性条件性敲除可导致成体小鼠甲状旁腺功能减退,提示Gcm2基因可能为甲状旁腺功能减退症的重要治疗靶点之一.
关键词： 甲状旁腺功能减退症 Gcm2基因 基因敲除 Cre-loxp系统 -
肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠的构建及鉴定
目的 构建肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠,并进行表型鉴定,为进一步研究C/EBPα在肾间质纤维化中的作用奠定基础.方法 利用C/EBPαflox/flox和pepck-Cre+转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁殖产生的第1代小鼠再次进行交配,得到第2代小鼠.通过PCR鉴定出基因型为C/EBPαflox/flox.pepck-Cre+的小鼠(C/EBPα-/-小鼠).采用RT-qPCR及免疫组织化学法分别检测肾组织中C/EBPα mRNA和蛋白表达水平.应用H-E染色、Masson染色观察6～8周龄C/EBPα-/-小鼠及野生型(WT)小鼠肾脏组织形态学改变.结果 2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律,交配后获得C/EBPα-/-小鼠.与WT小鼠相比,C/EBPα-/-小鼠肾脏中C/EBPα mRNA及蛋白表达水平下降,光学显微镜下肾脏组织形态无明显改变.结论 应用Cre-loxp系统可以成功地敲除小鼠肾小管上皮细胞中C/EBPα基因,且在基础情况下C/EBPα-/-小鼠肾脏组织无明显形态学改变.
关键词： Cre-loxp系统 C/EBPα 条件性敲除 肾小管上皮细胞 -
肝细胞Notch 1基因敲除小鼠模型的建立
目的 繁育和鉴定Notch 1基因敲除小鼠.方法 用B6.Notch 1flno/flox和B6.Alb-Cre转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁育出的第1代小鼠再进行相互交配,得到第2代小鼠.通过PCR鉴定出基因型为B6.Notch 1flno/flox.Alb-Cre的第2代小鼠.采用Western blot法检测Notch 1蛋白在肝脏中有无表达.结果 两种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律,可通过该方法获得较多的B6.Notch 1flno/flox.Alb-Cre小鼠.该基因型小鼠肝脏中不表达Notch 1蛋白.结论 应用Cre-loxp系统可以成功地敲除小鼠Notch 1基因.
关键词： Cre-loxp系统 Notch 1 基因敲除 -
基因敲除技术现状及应用
功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要.基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展.其中Cre-LoxP系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究.此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术.
关键词： 基因敲除 Cre-loxp系统 转座子 基因捕获 -
神经干细胞特异性PPARγ基因敲除小鼠模型的制备与鉴定
目的：制备与鉴定神经干细胞特异性PPARγ基因敲除小鼠模型。方法将引进的2种转基因小鼠B6.PPARγloxp/loxp、B6. Nestin-Cre进行饲养并杂交繁殖，将子一代小鼠与B6.PPARγloxp/loxp小鼠回交获得子二代小鼠，提取子二代小鼠的基因组DNA，利用PCR方法扩增Cre和loxp基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。选取基因型为B6.PPARγloxp/loxp.Nestin-Cre （KO）的小鼠即为神经干细胞特异性敲除PPARγ的敲除小鼠，另选基因型为B6.PPARγloxp/loxp（loxp）作为对照组小鼠。应用RT-PCR、实时荧光定量PCR方法鉴定神经干细胞特异性敲除PPARγ的敲除小鼠。结果敲除小鼠在基因鉴定时可以扩增得到PPARγloxp和Cre两个条带，在mRNA表型检测时脑内PPARγ表达显著低于对照组小鼠。成功获得神经干细胞敲除PPARγ基因的敲除小鼠。所购2种转基因小鼠均有繁殖能力，其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论基于loxp-Cre系统成功构建神经干细胞特异性敲除PPARγ的基因敲除小鼠，为进一步的神经系统疾病的治疗及其机制研究提供模型基础。
关键词： PPARγ 基因敲除 Cre-loxp系统 -
骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠的构建
目的 构建骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠并进行繁殖、基因型鉴定,为进一步研究neuritin蛋白治疗外周神经病变奠定基础.方法 将2对转基因小鼠loxp-stop-loxp-neuritin与转基因小鼠lyz-Cre/+进行饲养和繁殖,对其子鼠提取尾组织DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,获取基因型neuritin loxp/+_lyz-Cre/+即为骨髓特异性高表达neuritin小鼠.选择C57BL/6j野生型小鼠作为对照,并通过组织免疫荧光检测小鼠骨髓neuritin的表达量,进一步验证neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的准确性.结果 2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,相互杂交其子鼠基因型为neuritin loxp/+_lyz-Cre/+、neuritin loxp/-_lyz-Cre/+、neuritin loxp/+_lyz-Cre/-、neuritin loxp/-_lyz-Cre/-,其繁殖结果基本符合孟德尔遗传定律.免疫荧光结果显示:neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓neuritin表达量显著高于野生型小鼠(P<0.05).结论 PCR是小鼠基因型鉴定的可靠方法.雄性lyz-Cre/+小鼠与雌性neuritin loxp/+小鼠交配是获得neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的有效途径.
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Myostatin基因敲除对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响
目的 构建稳定的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因敲除小鼠模型,观察敲除MSTN基因对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响,并初步探讨其相关机制.方法 采用Cre-LoxP系统建立MSTN基因敲除的小鼠模型,通过PCR法鉴定子代小鼠基因型;比较MSTN基因敲除后小鼠体质量及腿部骨骼肌质量的变化;免疫荧光法检测野生型小鼠与MSTN基因敲除小鼠腿部骨骼肌纤维横截面积;qPCR法检测MST基因敲除小鼠Atrogin-1和MuRF-1 mRNA的表达.结果 PCR结果显示:子代小鼠的基因型符合MSTN-loxP+/+MCK-Cre+/-;与野生型小鼠(WT)相比,MSTN敲除小鼠(KO)体质量及骨骼肌质量显著增加,在出生第7、21天差异均具有统计学意义(P＜0.05),腿部骨骼肌纤维显著增粗,差异具有统计学意义(P＜0.01);而MSTN基因敲除后小鼠Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达较野生型小鼠显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 利用Cre-loxP系统成功建立稳定的MSTN基因敲除的小鼠模型,该小鼠腿部骨骼肌纤维增粗,其质量以及小鼠体质量显著增加,其机制可能与泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1的表达下调有关.
关键词： 小鼠 肌肉生长抑制素 Cre-loxp系统 基因敲除
