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成纤维细胞特异敲除转录因子ATF3基因的小鼠模型构建
目的:构建成纤维细胞特异敲除转录因子ATF3基因的小鼠模型.方法:利用胚胎显微注射法构建在ATF3基因携带loxP位点的小鼠(ATF3fl/fl),以成纤维细胞细胞特异性表达的Col1 a2-Cre介导ATF3条件性敲除,筛选出成纤维细胞条件性敲除ATF3的小鼠(Col1 a2-ERCre:ATF3fl/fl);取鼠尾DNA进行PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导该基因敲除;12只敲除小鼠和12只同窝野生型小鼠各分为心脏缺血再灌注(I/R)组和假手术(sham)组,术后2h取心脏组织研磨后流式细胞分选成纤维细胞,进而提取mRNA并反转为cDNA,采用实时荧光定量PCR检测ATF3的表达;另取4只敲除小鼠和4只同窝野生型小鼠复制I/R模型,术后6h取心脏组织进行免疫荧光染色,观察成纤维细胞ATF3表达.结果:鼠尾DNA PCR鉴定基因型结果显示Cre基因型为阳性,ATF3 loxP基因型为纯合阳性;与假手术组相比,野生型小鼠术后心脏成纤维细胞ATF3表达明显升高[(0.02534±0.002654)vs.(0.5982±0.03495),P＜0.0001],与术后野生型小鼠相比,术后条件性敲除组心脏成纤维细胞ATF3表达明显降低[(0.5982±0.03495)vs.(0.06456±0.005704),P＜0.0001];免疫荧光共定位染色显示野生型小鼠心脏成纤维细胞ATF3蛋白表达,条件性敲除小鼠ATF3蛋白未见表达.结论:成纤维细胞特异敲除ATF3小鼠构建成功,为进一步实验奠定基础.
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Pumilio1/Pumilio2双基因条件性敲除小鼠模型的建立及基因型鉴定
目的 建立及鉴定Pumilio1/Pumilio2(Pum1和Pum2)双基因条件性敲除的小鼠模型,为进一步研究PUF家族在哺乳动物精子发生中的生物学功能奠定基础.方法 将构建的Pum1条件性敲除和Pum2条件性敲除的两个品系小鼠进行交配并繁殖,终繁殖成功的子代小仔Pum1和Pum2两个基因均为纯合子.对子代以剪趾方式进行编号,提取子代小鼠脚趾或鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型.结果 Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型繁殖成功,同时获得更多PUF家族双基因条件性敲除的小鼠.结论 成功建立了Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型;正确的交配繁殖策略和鉴定方法是获得PUF家族双基因条件性敲除小鼠的有效途径.
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SENP1对小鼠B细胞数量及血清免疫球蛋白的影响初探
本研究利用Cre/LoxP系统构建B细胞条件性敲除Senp1基因小鼠模型(CKO),探讨了SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)对C57BL/6小鼠B细胞数量以及对血清免疫球蛋白产生的作用.利用流式细胞术检测对照组(WT)及实验组(CKO)小鼠骨髓、脾脏及淋巴结B细胞含量及分布情况,结果显示,Senp1敲除后可显著降低脾脏和淋巴结中B细胞的比例,而对骨髓中的B细胞比例没有影响.利用ELISA方法检测血清中免疫球蛋白IgM、IgG、IgG3及IgG1亚型的水平,结果显示CKO小鼠血清IgG1的含量明显低于WT小鼠,而IgM、IgG及IgG3含量没有显著差别.以上结果提示SENP1在小鼠外周淋巴器官B细胞分布及IgG1产生过程中可能起调控作用.
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肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠的构建及鉴定
目的 构建肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠,并进行表型鉴定,为进一步研究C/EBPα在肾间质纤维化中的作用奠定基础.方法 利用C/EBPαflox/flox和pepck-Cre+转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁殖产生的第1代小鼠再次进行交配,得到第2代小鼠.通过PCR鉴定出基因型为C/EBPαflox/flox.pepck-Cre+的小鼠(C/EBPα-/-小鼠).采用RT-qPCR及免疫组织化学法分别检测肾组织中C/EBPα mRNA和蛋白表达水平.应用H-E染色、Masson染色观察6～8周龄C/EBPα-/-小鼠及野生型(WT)小鼠肾脏组织形态学改变.结果 2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律,交配后获得C/EBPα-/-小鼠.与WT小鼠相比,C/EBPα-/-小鼠肾脏中C/EBPα mRNA及蛋白表达水平下降,光学显微镜下肾脏组织形态无明显改变.结论 应用Cre-loxp系统可以成功地敲除小鼠肾小管上皮细胞中C/EBPα基因,且在基础情况下C/EBPα-/-小鼠肾脏组织无明显形态学改变.
关键词： Cre-loxp系统 C/EBPα 条件性敲除 肾小管上皮细胞 -
胰岛B细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备
目的 制备胰岛B细胞特异性APPL1 (adaptor protein containing PH domain,PTB domain and Leucine zipper motif 1)基因敲除小鼠模型(B-APPL1KO).方法 采用基因剔除打靶技术,胚胎干细胞(ES)基因打靶,囊胚显微注射法制备嵌合小鼠,嵌合小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠繁殖APPL1-flox杂合子(APPL1flox/+)小鼠,APPL1-flox纯合子(APPL1flox/flox)小鼠由APPL1flox/+小鼠相互交配获得.利用Cre-LoxP系统繁育B-APPL1KO小鼠.繁育小鼠经尾端裂解提取DNA鉴定基因型,采用Western印迹法检测APPL1蛋白表达水平.结果 APPL1flox/flox和B-APPL1KO小鼠繁育成功.APPL1flox/flox小鼠胰岛组织有APPL1表达,而B-APPL1KO小鼠则无APPL1表达.APPL1 flox/flox和B-APPL1KO小鼠的脂肪组织均有APPL1蛋白表达.与APPL1flox/flox小鼠相比,B-APPL1KO小鼠的体重有增加的趋势,但两者间各时间点的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).两者间8、10周龄的空腹血糖和10周龄的空腹胰岛素水平的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 胰岛B细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型制备成功,为探讨APPL1在胰岛中的功能提供研究工具.
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Odaph对牙釉质发育影响的初步研究
目的 利用Runx2条件性敲除小鼠的转基因动物模型初步研究Odaph对牙釉质发育的影响.方法 PCR鉴定转基因小鼠的基因型,实时定量PCR实验方法检测Runx2loxp/loxp鼠和K14-cre-Runx2loxp/loxp基因敲除小鼠下颌磨牙区中Amelx,Ambn,Enam,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph基因mRNA的相对表达含量的改变,后用免疫组化技术检测Runx2及Odaph在基因敲除小鼠下颌磨牙区的表达情况.结果 实时荧光定量PCR结果显示:与野生型小鼠相比,在出生后10 d基因敲除小鼠中Amelx,Ambn,Enam基因mRNA的相对表达量均上调,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph的表达显著下降;免疫组化染色结果显示:Anti-Runx2在出生后10 d敲除型小鼠成釉细胞胞核中呈阴性表达,Anti-Odaph在出生后10 d野生型小鼠成釉细胞远端呈强阳性表达,然而在敲除型小鼠中表达不明显.结论 Odaph在牙釉质发育过程中具有重要作用.
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fgfr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定
目的构建成纤维细胞生长因子3型受体(fibroblast growth factor receptor-3,FGFR3)基因敲除载体,并对中靶ES细胞进行筛选与鉴定,为终建立FGFR3条件性敲除小鼠模型或FGFR3功能减低小鼠,研究FGFR3在小鼠骨骼等器官发育、损伤修复过程中的作用打下基础.方法在分析小鼠fgfr3基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了针对小鼠fgfr3外显子9、10的条件性基因敲除载体,采用电穿孔法转染ES细胞,用G418与Gancyclovir对电转的ES细胞进行正负筛选,后对ES细胞克隆做Southern与PCR鉴定.结果对ES细胞正负筛选后共挑取180个克隆;用5'端探针进行Southern杂交鉴定后发现2株阳性克隆;经PCR检测发现这两株克隆fgfr3的8号内含子内的LoxP序列丢失.结论得到两株fgfr3基因中只含有neo基因的ES细胞克隆,fgfr3的表达是降低的,可用来建立FGFR3功能降低的小鼠.
关键词： 成纤维细胞生长因子3型受体 条件性敲除 同源重组 Cre蛋白 ES细胞 -
FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定
目的构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblast growth factor receptor-2, FGFR2)条件性敲除载体,并对中靶ES细胞进行筛选与鉴定,为终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程中的作用打下基础.方法在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正负筛选,后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定.结果将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍保留外显子7、8两侧的loxP序列.结论 FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建.
关键词： 成纤维细胞生长因子2型受体 条件性敲除 同源重组 Cre蛋白 ES细胞 -
用重组工程技术快速构建 Shank3条件性敲除载体
目的:构建Shank3条件性敲除载体,终用于构建Shank3条件性敲除小鼠.方法:用重组工程技术来快速高效地构建条件敲除载体.结果:成功构建得到Shank3条件性敲除载体.结论:重组工程技术是一个用于构建条件性敲除载体成熟而高效的方法.
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强力霉素诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系的构建
目的 建立强力霉素(doxmycin,Dox)诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系,以满足不同条件下基因编辑的实验需求.方法 根据四环素(tetracycline,Tet)-on诱导表达调控系统的原理,分别构建含有调控元件反义Tet转录激活因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator,rtTA)的表达质粒pCDH-CAG-rtTA-IRES-mCherry和含有Tet应答元件(Tet-responsive element,TRE)及Cas9的表达质粒pTight-Cas9-IRES-GFP-Tight-Puro,其中红色荧光蛋白mCherry通过内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)与rtTA表达,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)通过IRES与Cas9相连,分别指示rtTA与Cas9的表达,Puro抗性基因作为药物筛选标记.将上述两种质粒包装为慢病毒,分步转入小鼠胚胎干细胞中,建立Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系.结果 首先通过瞬时转染方法在293T细胞中验证其可诱导性,然后结合报告荧光与药物筛选获得同时整合有调控元件rtTA与应答元件TRE及Cas9的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系加入Dox后出现有GFP报告荧光表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,rt-qPCR)结果同时表明Cas9可以被成功诱导表达.结论 本研究成功构建了Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系在基因编辑方法上更加灵活可控,具有很高的潜在应用价值.
关键词： CRISPR/Cas9 四环素诱导 条件性敲除 小鼠ES细胞系
