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家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因热点突变Taqman MGB探针检测方法的建立及应用
目的:建立Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测家族性高胆固醇血症(FH)患者低密度脂蛋白受体(LDLR)基因热点突变的简便方法.方法:①入选94例临床确诊FH患者为研究对象,30例健康人作为阴性对照及明确存在LDLR基因热点突变W462X、A606T和D601Y的FH患者各1例作为阳性对照,分别提取外周血DNA;②应用Primer Premier v3.0软件设计3个热点突变的特异性引物和Taqman MGB探针;③运用Taqman探针实时荧光定量PCR方法,对3例阳性对照及30例健康对照进行检测,检验方法的准确性;④同法检测94例确诊FH患者的基因组DNA;⑤运用Touch-down PCR方法对发现突变患者进行一代测序验证.结果:①3例阳性对照均检测到相应突变,30例健康对照均未检测到突变,证实此方法能够准确检测到基因突变位点;②94例确诊FH患者中发现13例W462X、3例A606T、1例D601Y,初步计算3个热点突变约占全部FH患者的18.1％;③对发现突变的17例患者进行一代测序验证,结果完全一致.结论:成功建立Taqman MGB探针实时荧光定量PCR方法,为FH患者LDLR基因热点突变的检测提供了快速可靠的技术手段.
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27个省市聋校学生基于SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变的全序列分析
目的 在全国27个省市聋校学生2352例中进行基于SLC26A4基因热点突变ⅣS7-2A＞G的该基因的全序列筛查,分析和探讨中国人SLC26A4基因相关大前庭水管综合征的分子流行病学状况.方法 调查对象来自全国27个省市自治区的聋哑学校学生2352例,共涉及21个民族.听力正常的对照人群150例.所有受检者均采集外周血并提取DNA,其中1552例以序列分析方法 检测SLC26A4基因外显子7+8以筛查热点突变IVS7-2A＞G,800例以试剂盒的方法 检测IVS7-2A＞G突变.对携带IVS7-2 A＞G纯合突变的个体结束筛查,对携带IVS7-2A＞G单杂合突变的个体进行SLC26A4基因其他外显子测序,寻找可能存在的另外一个突变位点.结果 2352例来自全国多个地区的耳聋患者中271例携带SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变,其中106例携带IVS7-2 A＞G纯合突变,165例携带IVS7-2A＞G单杂合突变,IVS7-2A＞G突变总检出率达到11.52％(271/2352),汉族患者中IVS7-2 A＞G突变检出率达到13.35％(254/1903);对165例携带IVS7-2A＞G单杂合突变的患者进行SLC26A4基因其他外显子序列分析显示其中105例找到另外一个突变位点,其余60例未找到另外的突变.2352例耳聋患者中基于IVS7-2A＞G突变的SLC26A4基因纯合及复合杂合突变携带者共211例,占总人数的8.97％(211/2352).其中1903例汉族耳聋患者中基于IVS7-2A＞G突变的SLC26A4基因纯合及复合杂合突变携带者共199例,占汉族人数的10.46％(199/1903).105例携带SLC26A4基因复合杂合突变的患者中,除IVS7-2A＞G突变外的另一突变位点主要存在于外显子19、10、17、11+12、3和15上.正常对照人群IVS7-2 A＞G突变检出率为2％,均为单杂合突变,且均未找到另一个突变.结论 2352例聋哑学生通过基于SLC26A4基因热点突变IVS7-2A＞G的该基因的全序列筛查,将211例耳聋患者明确为SLC26A4基因突变致聋;发现在中国由SLC26A4基因热点突变引起的大前庭水管相关遗传性耳聋的比例较高,接近9％,汉族耳聋人群中该比例超过10％;揭示SLC26A4基因筛查和诊断在耳聋的病因学诊断中起重要作用,在大规模耳聋患者的病因学筛查方面具有优势.点突变区域提供了依据.
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小儿非综合征型耳聋59例基因突变筛查分析
目的 筛查小儿非综合征型耳聋基因热点突变,初步了解耳聋基因热点突变谱系及发生频率.方法 收集2010年1月至2012年12月沈阳市妇女儿童保健中心收治的非综合征型耳聋患儿59例,经知情同意后,抽取外周静脉全血并提取基因组DNA,应用耳聋微阵列芯片检测中国人群中常见4个耳聋基因的9个突变位点,具体包括GJB2基因(235 del C、176 del 16、299 del AT和35 del G)、SLC26A4基因(IVS 7-2 A＞G、2168 A＞G)、线粒体mtDNA 12S rRNA基因(1494 C ＞T、1555 A＞G)、GJB3基因(538 C ＞T),分析检测结果.结果 59例非综合征型耳聋患儿GJB2基因、SLC26A4基因、mtDNA 12S rRNA 1555 A＞G基因突变检出率分别为25.4％、15.3％、0.具体包括:GJB2基因235 del C纯合突变型2例；GJB2基因235 del C/299 del AT复合杂合突变型3例；GJB2基因235delC/176 del 16复合杂合突变型1例；GJB2基因235 del C杂合突变型7例；GJB2基因299 del AT纯合突变型1例；SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G纯合突变型5例；SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G杂合突变型3例；GJB2基因235 del C/299 del AT,SLC26A4基因2168 A ＞G复合杂合突变型1例.59例中无mtDNA 12S rRNA基因1555 A＞G均质型突变和GJB3突变.GJB2基因突变中,极重度组和重度组检出率较高(43.8％和41.7％),其次是中度组10.5％、轻度组8.3％,差异有统计学意义(P＜0.05).SLC26A4基因突变中,重度组检出率较高,为41.7％,其次为中度组10.5％、轻度组8.3％和极重度组6.3％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本次研究耳聋患儿热点突变基因以GJB2基因和SLC26A4基因为主,在双耳重度、极重度耳聋患儿的阳性检出率较高.应重视对儿童人群常规耳聋基因的筛查诊断.
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乙型肝炎病毒X蛋白的优势氨基酸序列与热点突变位点的生物信息学分析
乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)全长154个氨基酸,与肝癌发生密切相关.为确定HBx的优势氨基酸序列和热点突变位点,在GenBank中下载所有HBx的氨基酸序列13950条,剔除插入突变、缺失突变和起始密码子非甲硫氨酸的序列,后保留7126条.通过分析这7126条序列,计算出HBx每个位点的氨基酸分布情况,出现频率高的氨基酸为该位点的优势氨基酸,其他氨基酸为突变氨基酸.154个位点的优势氨基酸组成HBx优势氨基酸序列.突变率>10.0%的热点突变位点有32个.其中第36、42、44、87、88和127位氨基酸有4种(突变率>1.0%)以上突变形式,具有较高的多态性.与肝癌密切相关的K130M/V131I双突变率为34.7%.通过7126条HBx序列与优势序列的同源性比较,随机选出其中50条序列(2条与优势序列同源性<75%,48条同源性为76%~99%),与23条参考序列及优势序列共同构建系统发生树.结果显示,HBx优势氨基酸序列属于基因型C,这与基因型C为全球主要流行型一致.本研究首次系统性分析了GenBank中HBx的优势序列,确定了32个HBx热点突变位点和6个多态性较高的位点,为基于HBx突变的基础和应用研究奠定了基础.
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乙型肝炎病毒携带产妇前C区和核心启动子区热点变异及其与宫内感染的关系
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)携带产妇前C区和核心启动子(CP)区热点变异情况及与宫内感染的关系.方法 采用HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒抽提99对无症状乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性携带临产孕妇及其新生儿血清HBV DNA,EIA法检测血清HBsAg、HBeAg,半巢式PCR法扩增产妇HBV前C区、CP区核苷酸片断,ABI3730型DNA自动荧光测序仪对PCR产物直接测序.结果 82例(单阳性52例,双阳性30例)孕妇HBV前C区和CP区核苷酸片断扩增测序成功.无症状HBV携带单阳性孕妇中1896G→A变异的检出率为21.2％(11/52,仅测到1例双阳性孕妇存在1896G→A变异);1899G→A变异仅发生在1例单阳性孕妇,且与1896G→A变异连锁出现.1762A→T/1764C →A变异总是连锁出现,且仅发生于单阳性孕妇,单阳性孕妇中双变异的检出率为17.3％(9/52).1896G→A变异和无该点变异孕妇所生新生儿宫内感染率分别为25.0％(3/12)和37.1％(26/70) (P＞0.05);1762A→T/1764GA变异和无该点变异的单阳性孕妇所生新生儿宫内感染率分别为22.2％(2/9)和37.2％(16/43)(P＞0.05).结论 HBV前C区和CP区1896G→A及1762A→T/1764G →A热点变异在无症状HBV携带单阳性孕妇中有较高的检出率,而在HBsAg、HBeAg双阳性孕妇中的检出率较低.HBV前C区和C启动子区热点变异对宫内感染率无显著影响.
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宁波地区非综合征型耳聋患儿耳聋基因热点突变筛查分析
目的 筛查分析宁波地区非综合型耳聋(NSHL)患儿耳聋基因热点突变情况,了解该地区耳聋患儿分子流行病学特征.方法 选取宁波市特殊教育中心就读的重度、极重度NSHL患儿168例,应用遗传性耳聋基因检测试剂盒,采用多重突变阻滞扩增系统毛细管电泳检测技术进行4个遗传性耳聋基因的29个位点的突变筛查.结果 本研究NSHL患儿中检出耳聋基因热点突变58例(34.52％),其中单-GJB2基因热点突变者43例,单-SLC26A4基因热点突变者9例,GJB2基因合并SLC26A4基因热点突变者3例,12S rRNA基因热点突变3例;GJB2、SLC26A4、12S rRNA基因热点总突变率分别为27.38％、7.14％和1.79％.在所有热点突变中,以GJB2 235delC突变率高(23.21％),其次是GJB2 299 del AT(5.36％).结论 宁波地区NSHL患儿热点突变耳聋基因以GJB2基因和SLC26A4基因为主,且GJB2 235delC是常见突变位点.
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云南省573名非综合征型聋学生SLC26A4基因IVS7-2A＞ G和2168 A＞ G的检测分析
目的：分析云南省部分聋校非综合征型聋学生常见致聋基因SLC26A4突变热点的携带情况，初步了解当地聋病的分子病因及其特点。方法采集云南省部分聋校573例非综合征型耳聋学生（耳聋组）及232例听力正常人群（对照组）的外周静脉血，提取基因组DNA ，PCR扩增含SLC26A4基因IVS7-2A＞ G、2168 A＞ G （H723R）位点的基因片段，将扩增产物直接测序，用GeneTool软件分析碱基序列。结果耳聋组中19例携带SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变（3．32％，19/573），其中6例为纯合突变，13例为杂合突变，等位基因频率为2．18％（25/1146）；携带2168 A＞G （H723R）突变5例（0．87％，5/573），其中1例为纯合突变，4例为杂合突变，等位基因频率为0．52％（6/1146）；3例为同时携带IVS7-2A＞G和2168 A＞G（H723R）的复合杂合突变（0．52％，3/573）。对照组中检测到SLC26A4基因IVS7-2A＞G杂合突变2人（0．86％，2/232），2168 A＞G （H723R）杂合突变1人（0．43％，1/232）。结论云南省部分聋校非综合征型聋学生携带SLC26A4基因IVS7-2A＞ G、2168 A＞G （H723R）突变率低于国内平均水平。
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荧光PCR法在非综合征型遗传性耳聋基因诊断中的应用研究
目的 分析GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA基因热点突变在非综合征型遗传性耳聋人群中的突变谱和突变频率.方法 采用荧光PCR法,针对本院收集的126例非综合征型耳聋患者进行中国人群常见的3个耳聋致病基因GJB2、SLC26A4和mtDNA 12SrRNA的10个热点突变的筛查,分析总结突变数据.阳性结果进一步采用直接测序法进行验证.结果 应用荧光PCR技术在126例非综合征型耳聋(non syndromic hearing loss,NSHL)患者中检测出携带基因突变的患者31例,阳性率为24.6％ (31/126),其中GJB2双等位基因突变、SLC26A4双等位基因突变和12SrRNA的均质突变分别占该人群分子病因的6.35％ (8/126)、2.33％(3/126)和3.17％(4/126).此外,IVS7-2A＞G单等位基因突变的检出率高达11.11％ (14/126).GJB2 c.235delC和SLC26A4IVS7-2A＞G是本研究中为常见的热点突变.进一步采用直接测序法验证阳性位点,其结果与荧光PCR法一致.结论 GJB2双等位基因突变是本研究人群为常见的分子致病因素,其次为SLC26A4双等位基因突变和12SrRNA的均质突变.GJB2 c.235delC和SLC26A4 IVS7-2A＞G是本研究中为常见的热点突变.
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线粒体脑肌病相关的线粒体DNA 突变
线粒体DNA（mtDNA）或核DNA突变可造成线粒体结构形态或（和）功能发生异常，由此导致的以神经肌肉系统（脑和肌肉组织）受累为主的多系统疾病，称为线粒体脑肌病。m tD‐NA突变是导致神经肌肉系统发生病变的重要原因之一。早在上世纪70年代，有研究者在患有脑肌病儿童的肌肉组织中首次发现了线粒体形态的畸变和呼吸链功能的缺陷，提示线粒体功能异常可能与该疾病有关［1］。1988年，Holt等［2］首先报道了mtDNA大片段缺失导致慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）和Kearne‐Sayre综合征的病例；同年，Wallace等［3］发现了首个与Leber遗传性视神经病变（LHON）相关的ND4 G11778A突变。mtDNA突变导致的线粒体功能异常在神经肌肉系统疾病领域的重要作用逐渐引起人们的关注。目前，已发现两百余种mtDNA突变与线粒体脑肌病相关，突变类型包括点突变、缺失突变及重复突变等，且存在热点突变［4］。本文简要介绍了线粒体脑肌病相关的mtDNA热点突变及其分子致病机制。
