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利用同源序列确定人GIPC2核心启动子和寻找可能的顺式作用元件
目的 利用同源序列确定人GIPC2核心启动子区和寻找可能存在的基因调控区域.方法 1)利用Vista比对不同物种GIPC2基因编码区和非编码区序列,得到GIPC2同源序列;2)分别构建插入人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游不同长度截短片段的重组质粒,转染人HEK293T细胞和大鼠PC12细胞;3)根据报告基因荧光强度推断人和大鼠GIPC2的核心启动子区;4)将人GIPC2内含子区同源序列置于核心启动子前面,构建重组质粒,转染HEK293T,HT-29和PC12细胞,检测启动子活性.结果 人GIPC2核心启动子区确定为+32至+190序列区域;人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2启动子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一个内含子内的同源序列有促进启动子活性的功能.结论 利用同源序列方法确定了人GIPC2基因的核心启动子区,并且找到能抑制和促进GIPC2启动子活性的可能的顺式作用元件.
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TDI-FP法分析肝细胞癌组织中HBV核心启动子双突变
目的:通过TDI-FP法检测肝细胞癌组织中HBV DNA核心启动子区A1762 T和G1764A双突变并分析二者之间的相关性,同时建立一种新的突变检测方法.方法:以20例肝细胞癌组织为研究标本,通过PCR扩增含有HBV DNA核心启动子区的DNA片段,然后用TDI-FP法检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值,鉴定nt1762和nt1764的基因型.结果:20例肝细胞癌组织中经HBV检测试剂盒鉴定后,18例为HBV感染阳性,阳性率为90%.经TDI-FP检测,其中有13例为T1762和A1764双突变型,1例为T1762-A1764/A1762-G1764突变杂合型,4例检测结果为阴性.经测序,阳性结果及突变杂合型与TDI-FP结果完全吻合,阴性结果中2例在nt1762前有8个核苷酸缺失突变,导致突变检测引物无法与模板结合,故产生TDI-FP检测出现假阴性结果.在肝细胞癌组织HBV DNA中,Ti762-A1764突变阳性率为75%,突变杂合型为5%,野生型为10%.结论:在肝细胞癌组织中,HBV感染率非常高,而且其核心启动子区出现nt1762和nt1764双突变率较高,提示双突变与肝细胞癌关系密切;同时本实验所建立的TDI-FP法操作快速简便,可以进行高通量自动化操作,具有进一步推广应用的前景.
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CREG基因核心启动子区的确定及其调控机制研究
目的：E1A 激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG）是Gill教授从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆出的一个转录相关调控因子，前期研究结果显示CREG可能是对抗内皮损伤、维持内皮细胞完整性的重要调控因子。应用生物信息软件预测人CREG基因的第一外显子区存在明显的CpG岛（0~+510 bp）。本研究的目的在于确定人CREG基因的核心启动子区及CpG岛在启动子区的作用，即CREG基因转录表达是否受甲基化机制调控，为进一步研究该基因的表达调控机制奠定基础。
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慢性乙型肝炎乙型肝炎病毒核心启动子区和前核心区基因变异后的预后分析
目的为了解慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(BCP)区和前核心(前C)区基因变异后的临床转归及其预后.方法采用DNA序列分析法检测123例HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者血清HBVBCP区(nt1762、nt1764)和前C区(nt1896)基因序列,并同步进行乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(抗-HBe)定量及肝功能检测.结果123例患者HBV BCP区(A1762T、G1764A)和前C区(G1896A)基因变异检出率为76.42%;其中肝炎肝硬化(HLC)患者双变异(A1762T、G1764A)和联合变异(A1762T、G1764A、G1896A)率高(52.94%与29.41%);慢性重型肝炎患者终止变异(G1896A)率高(42.86%);HBeAg/抗HBe转换率分别为:双变异组23.91%,终止变异组75.00%,联合变异组84.00%,无变异组13.79%.结论HBV BCP双变异、前C终止变异和联合变异均可引起慢性乙型肝炎病情加重及肝硬化的发生,但严重肝损伤与这3种变异之间可能无因果关系,只是HBV减少病毒蛋白的产生,逃避免疫监视的一种方式;推测BCP双变异和联合变异可能是引起HLC的重要病因之一;BCP区变异患者对干扰素治疗敏感.
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孕妇中乙型肝炎病毒前C区和核心启动子区热点变异研究
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)携带产妇体内HBV前C区和核心启动子(CP)区热点变异情况.方法 82例无症状慢性HBV携带临产孕妇采用HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒抽提孕妇血清HBV DNA,血清HBsAg、HBeAg采用EIA法检测,半巢式PCR法扩增产妇HBV前C区、CP区核苷酸片段,ABI 3730型DNA自动荧光测序仪对PCR产物直接测序.结果 82例无症状HBV携带临产孕妇中HBsAg单阳性52例,HBsAg、HBeAg双阳性30例;单阳性孕妇中1896G→A变异的检出率为21.2%(11/52),仅测到1例双阳性孕妇存在1896G→A变异,1899G→A变异仅发生在1例单阳性孕妇,且与1896G→A变异连锁出现.1762A→T/1764G→A变异总是连锁出现,且仅发生于单阳性孕妇,单阳性孕妇中双变异的检出率为17.3%(9/52).结论 HBV前C区、CP区1896G→A及1762A→T/1764G→A热点变异在无症状HBV携带单阳性孕妇中有较高的检出率,HBV前C区和核心启动子区的热点变异可能与肝损伤的严重程度无关.
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乙型肝炎病毒前C区和核心启动子区变异与基因型的关系及其临床意义
HBV变异率高,病毒本身又有不同的基因型和基因亚型,不同的基因型对目前使用的抗病毒药物的疗效不同.在亚洲地区,感染的HBV基因型主要是B和C型[1].实验表明,感染HBV B基因型较C基因型更易发生HBeAg血清学转换[2],而感染C基因型的肝脏炎性损伤比B基因型重[2-3],且发生肝细胞癌的风险也较高[4].
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乙型肝炎病毒携带产妇前C区和核心启动子区热点变异及其与宫内感染的关系
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)携带产妇前C区和核心启动子(CP)区热点变异情况及与宫内感染的关系.方法 采用HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒抽提99对无症状乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性携带临产孕妇及其新生儿血清HBV DNA,EIA法检测血清HBsAg、HBeAg,半巢式PCR法扩增产妇HBV前C区、CP区核苷酸片断,ABI3730型DNA自动荧光测序仪对PCR产物直接测序.结果 82例(单阳性52例,双阳性30例)孕妇HBV前C区和CP区核苷酸片断扩增测序成功.无症状HBV携带单阳性孕妇中1896G→A变异的检出率为21.2％(11/52,仅测到1例双阳性孕妇存在1896G→A变异);1899G→A变异仅发生在1例单阳性孕妇,且与1896G→A变异连锁出现.1762A→T/1764C →A变异总是连锁出现,且仅发生于单阳性孕妇,单阳性孕妇中双变异的检出率为17.3％(9/52).1896G→A变异和无该点变异孕妇所生新生儿宫内感染率分别为25.0％(3/12)和37.1％(26/70) (P＞0.05);1762A→T/1764GA变异和无该点变异的单阳性孕妇所生新生儿宫内感染率分别为22.2％(2/9)和37.2％(16/43)(P＞0.05).结论 HBV前C区和CP区1896G→A及1762A→T/1764G →A热点变异在无症状HBV携带单阳性孕妇中有较高的检出率,而在HBsAg、HBeAg双阳性孕妇中的检出率较低.HBV前C区和C启动子区热点变异对宫内感染率无显著影响.
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萍乡地区HBV前C区和BCP区基因突变研究
乙型肝炎病毒是一个双链DNA病毒.HBV感染能导致急、慢性的肝病,其中全球慢性乙型肝炎(CHB)患者超过3.6亿.每年由于HBV慢性感染引起的肝硬化、肝细胞癌死亡患者超过47万人[1].而由于HBV病毒的复制过程缺乏校对机制,在慢性感染的过程中发生基因突变的几率很高,相关研究多的HBV突变株主要有:一是发生在翻译水平的前C突变(G1896A):二是发生在核心启动子区(BCP区),即A1762T和G1764A的联合突变;三是发生在HBV DNA聚合酶(反转录酶)区的变异包括P区528、552位点的突变.我们采用生物芯片技术检测,对113例乙型病人HBV前C区和BCP区基因多态性进行分析,以探讨其临床意义,现报告如下:
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血管紧张素原基因5′端核心启动子区(-6)A-G和(-20)A-C变异与哈萨克族人原发性高血压相关性分析
目的研究血管紧张素源(angiotensinogen, AGT)基因核心启动子区域(-6)A-G和(-20)A-C位点变异与哈萨克族人原发性高血压相关关系.方法采用经典的饱和酚/氯仿抽提法提取哈萨克族正常人74名和高血压患者125例白细胞基因组DNA,通过PCR、单链构象多态性、限制性片段长度多态性和测序等技术,鉴定不同个体AGT基因核心启动子区域(-6)、(-20)位等位基因的类型,观察在高血压组和正常血压组不同基因型的分布和等位基因频率的差异.结果 (1)哈萨克族人AGT基因-164～+73区域仅存在(-6)A-G、(-20)A-C两种变异.(2)AGT基因(-6)位点AA、AG、GG基因型的频率在高血压组和正常血压组分别为0.39、0.45、0.16和0.49、0.49、0.02,两组之间差异存在显著性(χ2=8.56, P=0.014).A、G等位基因频率分别为0.62、0.38和0.73、0.27,差异存在显著性(χ2＝5.35,P＝0.021).(3)AGT基因(-20)位点AA、AC、CC基因型频率在高血压组和正常血压组分别为0.69、0.26、0.05和0.65、0.32、0.03,差异无显著性(χ2=2.42,P=0.30);A、C等位基因的频率分别为0.82、0.18和0.82、0.18,差异无显著性(χ2=0,P=0.99).(4)AGT基因(-6)、(-20)位点各基因型组间平均收缩压和舒张压水平差异无显著性(P>0.05).结论 AGT基因(-6)A-G变异与哈萨克族人原发性高血压相关,而(-20)A-C变异可能与哈萨克族人原发性高血压的发生无关.
