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利用同源序列确定人GIPC2核心启动子和寻找可能的顺式作用元件
目的 利用同源序列确定人GIPC2核心启动子区和寻找可能存在的基因调控区域.方法 1)利用Vista比对不同物种GIPC2基因编码区和非编码区序列,得到GIPC2同源序列;2)分别构建插入人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游不同长度截短片段的重组质粒,转染人HEK293T细胞和大鼠PC12细胞;3)根据报告基因荧光强度推断人和大鼠GIPC2的核心启动子区;4)将人GIPC2内含子区同源序列置于核心启动子前面,构建重组质粒,转染HEK293T,HT-29和PC12细胞,检测启动子活性.结果 人GIPC2核心启动子区确定为+32至+190序列区域;人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2启动子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一个内含子内的同源序列有促进启动子活性的功能.结论 利用同源序列方法确定了人GIPC2基因的核心启动子区,并且找到能抑制和促进GIPC2启动子活性的可能的顺式作用元件.
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通过配体文库研究GIPC2 PDZ配体结合特点及其相互作用蛋白
目的 通过验证性筛选配体文库,获得GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,进而找到GIPC2的相互作用蛋白.方法 1)利用酵母双杂交的方法从已有的PDZ配体库中寻找与GIPC2的PDZ结构域配体结合特性;2)根据GIPC2的亚细胞定位和肿瘤相关功能再结合PDZ结构域结合序列的共同特征在蛋白质数据库中预测GIPC2的天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列依次与GIPC2 PDZ结构域或GIPC2全长进行验证反应,从而得到阳性蛋白.结果 1)GIPC2 PDZ结构域的配体结合特性是C末端后4个氨基酸为-X-S/T-X-V/L/I,是Ⅰ类PDZ配体;2)综合GIPC2的生物学特征和GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,在蛋白质数据库中预测得到47个天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列克隆至酵母双杂交系统进行验证,后得到10个确定的阳性蛋白.结论 获得10个GIPC2相互作用蛋白.
