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人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析
本研究采用PCR方法从人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1) HXB2株tat基因中扩增编码Tat蛋白N末端1-21位氨基酸缺失的突变体Tat22-101基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat22-101,经双酶切及测序验证后,转化大肠埃希菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达及Ni2+ NTA柱亲和层析纯化.纯化后的突变体融合蛋白PET32a-Tat22-101经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,其相对分子质量约为26.9kD.该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测结果表明,pET32a-Tat22-101融合蛋白不仅较好地保留其免疫原性,而且能诱导产生高滴度的针对Tat N末端区之外的Tat其他功能区表位的抗体,为进一步研究Tat生物学功能和研制新型HIV Tat疫苗奠定试验基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 Tat蛋白 缺失突变 原核表达 免疫原性 -
乙型肝炎病毒前S基因区缺失突变发生机制的探讨
检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者和患者外周血内HBV前S区基因缺失突变的分子结构特点,探讨其发生机理.用聚合酶链反应方法从慢性乙肝患者和携带者血清中扩增出前S区基因片段,克隆、测序,分析缺失发生的结构特点,从而推测这些前S区基因缺失突变的产生机制.从262例慢性乙肝患者和103例无症状HBV携带者体内扩增出前S区片段,共在30例患者和携带者中检测出多种前S区基因缺失突变,主要集中于前S1区的3′端和前S2区的5′端.其中有9例患者和携带者体内存在完全一样的nt3019～nt3201 183bp的缺失突变,该缺失突变符合真核细胞mRNA剪接机制,在此位置上各基因型的序列高度保守.同时有另外两种缺失突变,即nt3019～nt3147 129bp缺失、nt3019～nt3109 91bp缺失也符合该剪接机制.有23种缺失突变部分于重复序列之间,符合逆转录过程中的模板转换机制所导致的缺失.根据前基因组RNA预测出二级结构,仅部分缺失突变在RNA二级结构中对应于局部的结构.此结果表明:HBV在外界因素mRNA的剪接机制和内在因素聚合酶蛋白的功能特点的共同作用下,产生各种突变,不同的机制将导致不同类型的缺失突变.除真核细胞mRNA剪接机制外,逆转录过程中的模板转换是主要机制之一.
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疑似假性肥大性肌营养不良症患儿Dystophin基因缺失突变分析
目的 了解中国汉族假性肥大性肌营养不良症(DMD/BMD)患儿基因缺失突变的特点.方法 经PCR和20对引物,对964例疑似DMD/BMD患儿Dystophin基因外显子缺失突变类型及断裂点进行检测分析.结果 有491例患儿(491/964,51.0％)存在基因缺失突变:其中75例基因缺失突变位于基因5’端区域(15.2％),402例基因缺失突变位于基因中央区域(81.7％),13例基因缺失突变范围跨越了以上两个区域(2.6％).检测到以50、49、48号外显子缺失突变为常见.74％患儿的Dystophin基因断裂点位于44～ 50号内含子,以44号内含子多(21％).结论 20对引物的PCR法能够检测超过半数的Dystrophin基因缺失突变,基因中央区缺失是中国汉族DMD/BMD患儿病例的主要基因缺失突变类型.
关键词： 假性肥大性肌营养不良症 缺失突变 聚合酶链反应 抗肌营养不良蛋白基因 -
鼻型自然杀伤/T细胞淋巴瘤肿瘤相关基因的研究进展
自然杀伤(NK)/T细胞淋巴瘤是原发于结外的淋巴瘤,亚洲和南美地区高发.男性多见.常见的部位是面部中线部位.临床上呈进行性的过程.同其他恶性肿瘤一样,该肿瘤的发生是一个多基因多步骤突变的过程.基因的突变包括点突变,缺失突变,甲基化等.由于NK/T细胞淋巴瘤常发生于鼻腔和副鼻窦,该部位送检组织一般较少,加上肿瘤组织本身坏死比较严重,故对该肿瘤进行基因方面的研究比较困难.
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即时定量PCR法和等位基因特异性寡核苷酸PCR法检测肺腺癌EGFR基因第21号外显子L858R突变的对比性研究
自从Lynch等[1]和Paez等[2]发现肺癌细胞中上皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶编码区基因突变以来,研究证明具有EGFR基因第19号外显子(de1746-A750)缺失突变或第21号外显子L858R错义突变的肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼进行分子靶向治疗的有效率高达80%以上,而对于缺乏EGFR突变的患者采用上述治疗则基本无效[3].
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ARID1A基因突变体的构建及其在肝癌细胞中的过表达鉴定
目的 构建人类染色体重塑复合物SWI/SNF(Switch/Sucrose NonFermentable)中重要组份ARID1A(A-T rich interaction domain)的突变过表达载体,并检测野生型ARID1A基因及突变型ARID1A基因在肝癌细胞株HepG2中的表达情况.方法 采用overlap PCR技术构建在野生型质粒pcDNA6-ARID1A基础上构建结构域缺失突变体pcDNA6-ARID1A/△ARID以及pcDNA6-ARID1A/△DUF3518;利用脂质体转染技术将野生型质粒以及构建的突变型质粒转染到肝癌细胞HepG2中进行过表达;通过Real-time PCR以及Western blot技术对野生型及突变型ARID1A在肝癌细胞中的表达情况进行鉴定.结果 经双酶切后SDS-PAGE分析以及测序验证,成功构建了真核表达载体pcDNA6-ARID1A的突变型质粒pcDNA6-ARID1A/△ARID以及pcDNA6-ARID1A/△ DUF3518;通过Real-time PCR以及Western blot的方法验证,ARID1A及ARID1 A/△ARID在肝癌细胞株HepG2中成功过表达,而ARID1A/△ DUF3518蛋白可能降解.结论 成功构建ARID1A功能域缺失型突变体,并在肝癌细胞株HepG2中稳定过表达ARID1A及ARID1A/△ARID;ARID1A/△ DUF3518蛋白的缺失暗示DUF3518结构域可能起着稳定蛋白结构的功能.
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NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用
目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.
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胰蛋白酶原基因缺失突变导致早发型自身免疫性相关的多器官多发囊肿的研究
目的：探讨由胰蛋白酶原基因（cationic trypsinogen， PRSS1）突变引发的早发型自身免疫性相关的多器官多发囊肿及其致病机制。方法采用DNA全长测序技术分析PRSS1、囊性纤维化跨膜通道调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR）、丝氨酸蛋白酶抑制剂 Kazal 1型（serine protease inhibitor Kazal type 1， SPINK1）、蛋白激酶D（protein kinase D， PKD）1和PKD2等胰腺炎和多囊性病变相关基因的所有外显子及其侧翼内含子剪切区域，确定DNA和cDNA序列的变异，通过与家系内部和正常对照的比较分析，对检测到的变异是否与疾病相关进行探讨，并构建突变体表达体系进行功能学验证，同时对患者的肺、肝、胰腺等穿刺样本进行免疫组织化学和特殊染色。结果在2例年轻的自身免疫性胰腺炎患者中首次发现PRSS1基因2号外显子缺失突变生成激活肽缺失型的胰蛋白酶原，并具有生物学活性；肝脏、肺穿刺病理均可见不同程度的淋巴细胞和浆细胞浸润，肺组织病理显示弹力纤维、网状纤维明显减少；患者表现为多脏器多囊性病变，血清胰蛋白酶、弹力蛋白酶、AAT显著增高。使用糖皮质激素治疗有效。结论 PRSS1：c．1300_1304 del CCCAG是引发早发型自身免疫性胰腺炎的新突变形式，并与多器官囊肿关系密切。
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多发性内分泌腺瘤病2A型家系临床特点分析及RET基因突变研究
目的 检测互不相关的3个多发性内分泌腺瘤病2A型(MEN2A)家系中BET原癌基因突变情况,以探寻其发病的分子机制,同时总结其临床特点.方法 收集3个MEN2A家系,共有8例MEN2A患者,3个家系有28位同意进行基因检测,提取28位外周血基因组DNA,对BET原癌基因21个外显子进行聚合酶链反应(PCR),PCR产物进行直接测序,对发现新的突变点进一步进行克隆测序.结果家系1 BET原癌基因存在外显子11的C634R突变,家系2为C634Y突变,家系3的4例MEN2A患者均存在D631密码子(GAC)的杂合缺失,碱基序列由TGC∧GACGAGCTG变为TGCGAGCTG,导致代表天冬氨酸的D631的缺失,即del D631.8例MEN2A患者中7例有MTC(87.5%),8例有PCC(100%).未发现有阳叮的发生,其中6例(75%)患者是以PCC起病,而且PCC中7例(87.5%)为双侧.结论 本研究结果提示中国大陆MEN2A家系存在C6MY突变,也有exon11的D631杂合缺失突变,其中BET基因第11号外显子的D631缺失突变(delD631)是首例报道.13631 del临床特点为发病年龄较迟,肾上腺嗜铬细胞瘤可先于甲状腺髓样癌的发生.
关键词： 多发性内分泌腺瘤2A型 BET原癌基因 缺失突变 -
HBV前S缺失突变对病毒复制力及表面抗原启动子Ⅱ转录活性的下调作用
目的：分析HBV前S缺失突变病毒株体外复制力及其对表面抗原启动子（surface antigen promoter, SP）Ⅱ转录活性的影响。方法研究对象为119例解放军第三〇二医院的住院患者，包括38例慢性乙型肝炎（慢乙肝）轻中度、40例慢乙肝重度和41例慢加急性肝衰竭。从患者血清中提取HBV DNA，PCR扩增HBV全长基因组，统计前S缺失突变的发生率。挑选代表前S缺失突变株及其相应对照的HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中。用BspQⅠ/ScaⅠ双酶切1.0倍HBV基因组，转染HepG2细胞，72 h后检测病毒复制力；用PCR分别扩增含前S缺失突变型和野生型的HBV SPⅡ启动子片段，构建pGL3-SPⅡ双荧光素酶真核报告表达载体，转染HepG2细胞48 h后检测相对荧光素酶活性，分析前S1缺失突变对重叠的SPⅡ荧光素酶表达的影响。结果①HBV基因组前S缺失突变检出率在慢乙肝轻中度、慢乙肝重度和慢加急性肝衰竭3组中逐渐递增，分别为5.3%、12.5%和24.4%，差异有统计学意义（P<0.05）；②前S缺失突变病毒株的复制力较相应野生株降低69%；③与野生型相比，前S1缺失突变使重叠的SPⅡ转录活性降低了36%。结论 HBV前S缺失突变发生率随乙肝进展而升高，前S缺失突变株复制力降低，导致重叠的SPⅡ转录活性降低。
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一种新的乙型肝炎病毒X基因变异方式
目的:证实乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因一种新的变异方式.方法:从HBV慢性感染患者血清中提取HBVDNA,扩增X基因序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异位点以及变异形式.结果:从21例患者中共挑选74个克隆测序,测序结果提示54个克隆X基因下游大段缺失突变,长度达234 nt,位于1601-1834 nt处,另有1个克隆发生245 nt缺失突变.发生缺失变异的病毒株同时存在G/A1515C、G1518C和A1585T替换突变,这两种突变具有联动特征.缺失突变株HBx仅编码76 aa其第44和45位编码为LL,具有特异性.结论:观察到一种X蛋白变异方式,这种大段缺失突变导致X蛋白下游编码序列丢失,其为X因子还是X蛋白以及这种变异是否为常态形式尚需进一步研究.
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乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析
目的:从中国慢性乙型肝炎患者的血清中,应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列,建立中国HBV流行株的参考标准序列.方法:从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA,以L-PCR技术对于3 200 bp的HBV DNA进行扩增,纯化后克隆到TA载体中进行序列分析.对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析.结果:克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3,全基因序列长度分别为3 125、3 215、3 213、3 182和3 215碱基对(bp),在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961.其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者,G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者.G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区.其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变.来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别,但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性.G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变,但不在多聚酶蛋白的活性结构区,因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性.G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区,使其多聚酶区结构被破坏.5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守.但是相对来讲,X蛋白的氨基末端更为保守,羧基末端序列有一定程度的变异.结论:克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列.
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TDI-FP法分析肝细胞癌组织中HBV核心启动子双突变
目的:通过TDI-FP法检测肝细胞癌组织中HBV DNA核心启动子区A1762 T和G1764A双突变并分析二者之间的相关性,同时建立一种新的突变检测方法.方法:以20例肝细胞癌组织为研究标本,通过PCR扩增含有HBV DNA核心启动子区的DNA片段,然后用TDI-FP法检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值,鉴定nt1762和nt1764的基因型.结果:20例肝细胞癌组织中经HBV检测试剂盒鉴定后,18例为HBV感染阳性,阳性率为90%.经TDI-FP检测,其中有13例为T1762和A1764双突变型,1例为T1762-A1764/A1762-G1764突变杂合型,4例检测结果为阴性.经测序,阳性结果及突变杂合型与TDI-FP结果完全吻合,阴性结果中2例在nt1762前有8个核苷酸缺失突变,导致突变检测引物无法与模板结合,故产生TDI-FP检测出现假阴性结果.在肝细胞癌组织HBV DNA中,Ti762-A1764突变阳性率为75%,突变杂合型为5%,野生型为10%.结论:在肝细胞癌组织中,HBV感染率非常高,而且其核心启动子区出现nt1762和nt1764双突变率较高,提示双突变与肝细胞癌关系密切;同时本实验所建立的TDI-FP法操作快速简便,可以进行高通量自动化操作,具有进一步推广应用的前景.
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心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因缺失突变导致肥厚型心肌病特点分析
目的 观察肥厚型心肌病(HCM)患者心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)缺失突变及其表型的特点.方法 在100 例HCM患者中对MYBPC3的所有外显子及其侧翼内含子序列进行基因扫描,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,双脱氧末段终对突变患者进行家系调查,分析其表型特点.结果 在两例先证者中分别发现两个缺失突变14262_14264delAAG和14364delG,均位于外显子25.表型分析发现两例先证者均有劳力性胸闷、胸痛和晕厥史,超声心动图表现为不对称性肥厚(室间隔/左室后壁分别为2.5、3.2),但SAM征阴性,发病年龄分别为38岁和29岁.结论 缺失突变是MYBPC3基因突变的常见形式,14262_14264delAAG或14364delG突变导致的HCM表现为不对称性心肌肥厚,患者容易出现晕厥等症状,应该警惕心源性猝死的发生.
关键词： 肥厚型心肌病 心脏型肌球蛋白结合蛋白C 缺失突变 表型 -
乙型肝炎病毒核心启动子缺失突变的初步观察
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)e抗原阴性患者HBV核心基因启动子变异方式.方法 自5例慢性HBV感染者血清中分别提取HBV DNA,应用多重PVR法鉴定其基因型.PCR扩增X基因序列,克隆入pMD19 T载体,共挑选23个克隆测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异程度.结果 5例患者中3例基因型分别为B、C和B/C混合型.2倒患者通过现行多引物方法 无法分型.16个(16/23,69.6%)克隆在X基因下游出现大段缺失突变,其中15例缺失长度为234 bp,1例为245 bp.缺失突变区域包括C基因启动子区,并导致前-C区起始密码子ATG编码缺失,这种缺失突变在5例患者中均被检出.结论 CP/HBeAg始密码子缺失突变可能是HBeAg阴性慢性乙型肝炎的一种变异模式.
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MEF2A基因21碱基特异性缺失突变的检测及其临床意义的探讨
本研究旨在检测中国汉族人群MEF(myocyte enhance factor)2A基因第11号外显子区21-bp的特异性缺失突变,并分析其临床意义.一、资料与方法1.病例选择:收集北京医院536例经冠状动脉造影证实至少有一支冠状动脉狭窄程度≥75%者为冠心病组,平均年龄(64.9±11.1)岁,男性393例(73.3%).232例经冠状动脉造影证实无冠状动脉堵塞者为对照组,平均年龄(57.0±11.1)岁,男性118例(50.9%).将232例无冠心病病史的健康体检者作为健康组,调查正常人群中MEF2A基因21-bp缺失突变的分布.
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Birt-Hogg-Dubé综合征的诊断及伴发肾癌的临床表现
1概述
1977年，Birt、Hogg和Dubé3人首次在文献中报道了Birt-Hogg-Dubé（BHD）综合征［1］。BHD综合征是一种常染色体显性遗传病，其遗传学基础是FLCN基因的缺失突变，临床上主要表现为多发性纤维毛囊瘤，多发性肺囊肿，自发性气胸及双侧多发肾细胞癌［2］。2001年，研究发现引发BHD综合征的相关基因位于常染色体17 p11．2，而终FLCN基因的缺失突变被确定为BHD综合征的遗传学病因［2，3］。FLCN基因编码 FLCN蛋白，但其具体功能尚未完全明确［4］。目前在全世界范围内总共有大约200个家族聚集性的BHD病例，每个BHD病例的染色体和基因检测均发现FLCN基因的缺失突变［5-11］。BHD综合征患者可以表现为单一的病变，也可以同时有多发性纤维毛囊瘤、多发性肺囊肿及双侧多发肾细胞癌等多种临床表现，因此 BHD综合征容易被误诊为其他病变［12-15］。1993年，Roth等人首次报道了BHD综合征伴发双侧肾癌的病例，目前已经明确FLCN基因的缺失突变可以引发不同组织学类型的肾细胞癌［11-15］。BHD综合征伴发的肾肿瘤大多发病年龄较低，而且可能呈现出家族聚集性的特点［5，7］。 -
悬浮阵列技术在地中海贫血基因诊断中的应用
目的 地中海贫血是由于α/β-珠蛋白基因突变或缺失导致的α/β链生成不足或完全缺如引起的以珠蛋白生成障碍为特点的遗传性血液病.本研究旨在研发一个针对中国南方人群高发位点的地贫检测平台 ,并了解广东省各地区地贫基因流行性情况.方法 基于悬浮阵列技术开发一个能同时检测中国南方人群高发的20种地中海贫血点突变及3种缺失突变的平台 ,利用200多例已知地贫基因型的样本评估引物和探针的性能 ,以及确定突变位点检测探针的截断值 ,并将此方法用于广东省地贫防控项目中的81 052例标本 ,以分析广东省各地区地贫流行性现况.结果 本平台使用的微球反应面积大及探针数量多 ,加快了检测速度 ,可同时检测20种突变型地贫基因与3种缺失型地贫基因.广东省地贫防控项目中的81 052例标本中 ,共检出12 296 (15 .20% )例携带地贫基因 ,其中8975 (11 .07% )例携带α地贫基因 ,2857 (3 .52% )例携带β地贫基因 ,464 (0 .57% )例携带α地贫基因及β地贫基因.结论 悬浮阵列技术是一种快速、准确、经济的技术 ,尤其适用于大规模地贫基因诊断.
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用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA
目的:用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变.方法:用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌,利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至N基因长约2 100 bp的DNA序列,并用kil-N序列中含有的单一酶切位点XhoⅠ对混合质粒进行酶切,取酶切产物转化W3110感受态细胞,菌落PCR方法筛选重组阳性克隆.结果:在没有任何筛选标记的情况下,用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆.结论:该方法操作简单、精确,能够避免引入新突变,为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法.
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线粒体DNA缺失的检测方法及其在辐射生物学中的研究进展
线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是惟一的核外遗传物质,每个细胞中约有100～1000个mtDNA分子.人类mtDNA是含有16 569 bp的双链闭环分子,mtDNA含有37个编码基因及一段与mtDNA复制及转录有关、不编码基因的D环区,任何突变都会累及基因组中的重要功能区域.它位于线粒体的内膜,容易遭受到活性氧自由基侵害,同时缺乏有效的修复系统及组蛋白保护,其突变率远远高于核DNA,为核DNA的10～20倍[1].研究认为:mtDNA突变与衰老和多种疾病有关[2].在各类突变中,mtDNA的缺失突变成为生物医学领域的研究热点.在辐射生物学领域,对线粒体DNA缺失的研究刚刚起步.笔者就mtDNA缺失、其检测方法以及在辐射生物学领域中的研究进展作一概述.
