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浅析原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义
目的:了解前X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前X基因和HBV基因型与HCC的临床关系方法:患有乙肝的肝细胞肝癌患者(HCC )35例,采用型特异性引物巢式聚合酶链反应进行基因分型.结果:HCC患者35例中B基因型1例,C基因型24例,B/C混合基因型8例,未定型者2例.明确基因型的患者33例,进一步扩增前结论:HCC患者中C基因型、B/C混合基因型较为多见.前X多肽在HCC患者中有较高的编码率,前X区多肽可能和HCC之间有一定相关性.
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四环素基因表达调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株的建立
目的建立稳定、高效的HBxAg体外表达细胞株,以便进一步研究HBV X基因和HBxAg的致癌作用及机理.方法构建带有完整四环素基因关闭(Tet-off)系统的HBV X基因重组表达质粒pBPSTR1-FlagX,用该重组质粒转染NIH 3T3细胞,筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆,用抗-FlagM2单抗和兔抗-HBx作蛋白质免疫印迹分析,检测细胞内Flag-HBxAg表达和四环素调控其表达的情况.结果重组质粒pBPSTR1-FlagX转染NIH 3T3细胞后获得30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆.其中12个细胞克隆有Flag-HBxAg的稳定表达,且有5个克隆的Flag-HBxAg表达受四环素调控.当四环素浓度逐渐增高时,细胞内Flag-HBxAg的表达逐渐减弱.四环素浓度达1μg/ml时,Flag-HBxAg表达被完全抑制.结论本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株,该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg,而且具有定时"开""关"和定量调节HBxAg表达水平的特性,是HBV X基因功能研究的一个有用工具.
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10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒X基因表达的抑制作用
目的 以增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告分子,探讨10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3种能针对HBV X基因的特异性10-23DNAzymes,分别命名为DrzHBVX-7、DrzHBVX-8和DrzHBVX-9,能分别特异地识别HBV X基因开放阅读框(ORF)的A1376UG.将内有HBV X全基因片段(不含终止密码)的融合表达质粒pHBx-EGFP与10-23DNAzyme共转染AD293细胞作为共转染组,用pHBx-EGFP单独转染AD293细胞作为对照组,分别用荧光显微镜观察并用流式细胞仪检测细胞荧光强度,同时用半定量一步法RT-PCR分析融合荧光蛋白HBx-EGFP mRNA的相对表达量.结果 各共转染组细胞荧光蛋白HBx-EGFP的表达均明显弱于对照组(P＜0.05);各试验组HBx-EGFP mRNA的相对表达量与对照组比较也均明显减少(P＜0.05);各共转染组细胞之间HBx-EGFP的表达及HBx-EGFP mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 10-23 DNAzyme对HBV X基因的表达有特异抑制作用,在HBV感染的基因治疗中会有潜在的应用价值.
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慢性乙型肝炎组织病理学指标及病毒X基因变异与患者预后的相关性研究
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关组织病理学指标及病毒X基因变异与慢性乙型肝炎患者预后转归的关系.方法 对1986-1994年间慢性乙型肝炎肝穿刺活检病例进行预后随访,83例样本按患者有无肝细胞癌和肝硬化的发生分为3组:癌变组、硬化组和非硬化组.另取20例HBV相关性肝细胞癌作为对照研究.肝损伤活动程度用Scheuer评分表示;免疫组化二步法显示肝组织内HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测肝组织HBV DNA含量;PCR方法扩增HBV X基因ntl583～1793区段,目的条带经胶回收后直接双向测序.结果 HBV 4种病毒蛋白在肝组织内均有不同程度的表达,以HBsAg强,HBeAg弱;核苷酸错义突变发生于ntl632～1636(AA 87/88)、1719(AA 116)、1725～1730(AA 118/119)、1752(AA 127)、1762和1764(AA 130/131)位点.统计学分析结果显示,Scheuer评分的G分级(P=0.001)和S分期(P=0.000)硬化组显著高于非硬化组;肝组织内HBeAg的表达硬化组也比非硬化组高(P=0.008).ntl762/1764双突变在癌变组所占比例明显高于非癌变组(P=0.011);ntl725～1730野生型(P=0.024)和nt1762/1764突变型(P=0.001)在肝癌组中所占比率均明显高于慢性肝炎组.结论 Scheuer评分和肝组织内HBeAg的表达与慢性乙型肝炎患者肝硬化的发生有关;nt1762/1764突变能显著增加慢性乙型肝炎患者肝细胞癌的发生率.
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乙肝病毒X基因与肝癌
目前公认肝癌(HCC)的发病是多因素协同作用的结果,其中乙肝病毒(HBV)感染是HCC的主要病因之一.流行病学调查表明HBV感染者HCC的发病率较对照人群高出200倍以上.虽然HBV的确切致癌机制尚未完全阐明,但随着分子病毒学的研究进展,人们对HBV X基因及其产物X蛋白(pX)与HCC之间的关系已有了多方面及多层次的了解,积累了大量研究资料.
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X基因——抗乙型肝炎病毒治疗的新靶点
X基因是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的四个基因之一.近的研究表明,他不仅参与HBV感染宿主过程,还影响HBV病毒基因的复制和表达,直接或/和间接通过宿主的免疫反应或其他作用,导致HBV致病的系列病理过程,而且在HBV生命周期中具有非常重要的作用.降低或去除X基因转录,或者封闭X蛋白某些功能以及使X基因表达沉默均能显著抑制病毒复制水平.本文通过对X基因在HBV复制和基因表达中的作用以及针对X基因的干预对HBV复制和基因表达的影响的新研究成果进行综述,提出X基因是乙肝抗病毒治疗的一个新靶点.
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乙型肝炎病毒核心启动子缺失突变的初步观察
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)e抗原阴性患者HBV核心基因启动子变异方式.方法 自5例慢性HBV感染者血清中分别提取HBV DNA,应用多重PVR法鉴定其基因型.PCR扩增X基因序列,克隆入pMD19 T载体,共挑选23个克隆测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异程度.结果 5例患者中3例基因型分别为B、C和B/C混合型.2倒患者通过现行多引物方法 无法分型.16个(16/23,69.6%)克隆在X基因下游出现大段缺失突变,其中15例缺失长度为234 bp,1例为245 bp.缺失突变区域包括C基因启动子区,并导致前-C区起始密码子ATG编码缺失,这种缺失突变在5例患者中均被检出.结论 CP/HBeAg始密码子缺失突变可能是HBeAg阴性慢性乙型肝炎的一种变异模式.
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乙型肝炎肝硬化患者与乙型肝炎病毒携带者乙型肝炎病毒X基因序列比较研究
目的 研究乙型肝炎肝硬化患者与乙型肝炎病毒(HBV)携带者HBV X基因序列的差异.方法 对20例标本的PCR产物进行直接测序;并对3例乙型肝炎肝硬化患者和3例无症状HBV携带者HBV DNA的扩增片段进行克隆测序,并分析比较.结果 肝硬化患者中X基因核心启动子双突变T1762/A1764、G1719T、T1727G/A、G1730C、T1753C等变异高于HBV携带者;前者X启动子区变异率明显高于后者;乙型肝炎肝硬化同一患者X区不同克隆之间的碱基序列同源性为91.3%～99.7%,而HBV携带者为96.0%～100.0%.结论 乙型肝炎肝硬化患者,HBV DNA X区的CP启动子区以及X启动子区变异程度明显高于HBV携带者,同时乙型肝炎肝硬化患者体内存在变异程度更大的HBV准种群.
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慢性乙型肝炎病毒感染与p16INK4A基因启动子甲基化关系的研究
目的 探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染对p16INK4A基因启动子甲基化的影响及其在HBV相关肝细胞癌(HCC)形成中的作用.方法 选取23例HBV相关HCC癌及癌旁组织、25例慢性乙型肝炎肝穿刺组织,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测p16INK4A基因启动子的甲基化状态;免疫组化EnVision二步法测定肝组织内HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测肝组织HBV DNA含量;PCR扩增和直接测序检测HBV x基因变异.结果 癌组织p16INK4A基因启动子甲基化阳性率(47.83%)明显高于癌旁组织(17.39%),慢性乙型肝炎患者p16INK4A基因启动子甲基化阳性率(36.00%)与癌组织、癌旁组织差异无统计学意义.在癌旁组织和慢性乙型肝炎,p16INK4A基因启动子甲基化者HBx蛋白表达中位数分别为3.000和0.250,明显高于非甲基化者(0.500和0.000),但在癌组织中,HBx蛋白的表达与p16INK4A基因启动子甲基化状态无关.HBsAg、HBcAg、组织HBV DNA含量和x基因突变均与p16INK4A基因启动子甲基化状态无关.结论 在癌前病变中,p16INK4A基因启动子甲基化与HBx蛋白高表达有关,HBx蛋白可能通过诱导p16INK4A基因启动子甲基化而使该抑癌基因失活,在HBV相关HCC形成中起重要作用.
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乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响
从慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列,克隆入pGEM-Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度.结果提示,HBV长期携带者体内有HBV准种共存,X区内存在热点缺失突变区.为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响,将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点,构建重组表达质粒,并分别与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液,检测SV40启动子调控下的β-半乳糖苷酶表达活性.共转染结果显示:野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子.提示X区不同核苷酸缺失突变和点突变均在不同程度上降低了其反式激活作用.
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HBx与肝细胞肝癌的发病机制
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,居我国癌症死亡的第三位.大约80%的HCC与乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染有关,但HBV蛋白在HCC中的具体作用依然不清.流行病学调查显示血中乙型肝炎表面抗原(hepatitis BS antigen,HBsAg)阳性持续感染者比非感染者的HCC的发生率高100倍以上.乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)作为恶性转化肝细胞中唯一表达的蛋白质,与HCC的发生与发展密切相关.深入研究HBx有助于揭示HCC的发生机制,为临床预防和治疗提供依据.
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靶向整合于MHCC 97-H细胞的HBx基因shRNA表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞乙型肝炎病毒x基因(HBx gene)基因的shNA真核载体.方法 依据从人肝癌细胞株MHCC97-H中克隆的HBx基因序列,设计合成X169,X220及MOCK(无关对照)3对寡核酸,经退火成互补双链并克隆至pGenesiH载体;经酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,流式细胞分析转染效率.结果 酶切、PCR及测序证实pshRNA-X169/X220/MOCK质粒构建符合设计,转染48 h后MHCC97-H细胞可激发绿色荧光,pshRNA-X220转染效率低.结论 成功构建靶向整合于人肝癌细胞HBVx基因特异性sRNA表达载体,并成功转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,为沉默HBx基因实验性肝癌基因治疗奠定基础.
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乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体的检测及临床意义研究
目的 获得重组HBx蛋白,检测乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体并探讨其临床意义.方法 利用分子克隆技术克隆HBV X基因构建PET32a-HBX原核表达载体,表达和纯化HBx蛋白,用该重组蛋白建立检测抗-HBx抗体的间接ELISA方法;采用该ELISA分别检测正常人组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组患者血清中的抗-HBx抗体.结果 获得具有免疫原性的HBx融合蛋白;ELISA检测表明,慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体的水平均高于急性肝炎组,差异具有显著性;在这三组之间,慢性肝炎组高于肝硬化组和肝细胞癌组,差异具有显著性,肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体水平无显著性差异.结论 HBV患者血清中抗-HBX抗体是乙型肝炎病毒感染的一种特异性抗体,是HBV感染的血清学指标之一,可以反映乙型肝炎肝炎患者病情的变化.
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微孔板杂交检测乙肝病毒X基因及其对肝细胞癌诊断价值的研究
目的 建立微孔板杂交技术检测乙肝病毒X基因的方法,研究其在肝细胞癌诊断中的应用价值.方法 在微孔板上包被HBV X基因片段的捕获探针;应用Bio-11-dUTP修饰的HBV X基因扩增引物,对待测标本进行PCR扩增,在微孔板上杂交后用链霉亲和素碱性磷酸酶系统显色.结果 成功建立了微孔板杂交技术检测HBV X基因的方法;乙肝病毒感染后肝细胞癌患者X基因阳性检出率明显高于慢性乙肝患者和肝纤维化患者(P＜0.01).结论 检测HBV X基因对肝细胞癌具有辅助诊断价值.
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中老年肝细胞癌患者乙型肝炎病毒X基因检测与分析
目的 检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后肝细胞癌(HCC)患者血清HBV X基因,并与慢性乙型肝炎、肝硬化患者HBV X基因检出率对比分析.方法 在微孔板上包被HBV X基因片段的捕获探针;PCR扩增被检标本中目的片段,其引物用Bio-Ⅱ-dUTP修饰,在微孔板上杂交后用链霉亲和素碱性磷酸酶系统显色.结果 该方法检测HBV X基因灵敏,特异;乙型肝炎后HCC患者HBV X基因检出率明显高于慢性乙型肝炎组和肝硬化组.结论 检测HBV X基因对HCC具有辅助诊断价值.
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乙型肝炎病毒X基因的克隆与鉴定
目的 构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,以进一步研究其基因产物的功能及致病机制.方法 以肝炎患者血清DNA为模板,用PCR方法扩增乙型肝炎病毒X基因,构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,经酶切电泳验证重组质粒的正确性,并对X基因进行测序鉴定.结果 PCR结果显示,扩增片断大小约465 bp,与预期相同.重组质粒经酶切电泳判断有目的片段插入,方向正确,经测序证实插入片段是乙型肝炎病毒X基因,编码框无误.结论 成功构建乙型肝炎病毒X基因重组质粒pQE30-HBx.
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乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建
目的 构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定.方法 用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+ )载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+ )-HBx.以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的 蛋白.结果 pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+ )-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件.
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双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染
目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.
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乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的表型分析
目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白致转基因小鼠的表型效应.方法:采用免疫组织化学和组织病理学方法分析转基因小鼠中X蛋白的表达部位及其病理学改变.结果:免疫组织化学检测发现X蛋白在转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤组织中均有表达,从F0代到F3代小鼠,X蛋白在肝细胞中的分布逐渐从细胞质向细胞核转移.病理学分析显示,表达X蛋白的转基因小鼠出现了皮肤组织结构异常、肝组织和肺组织轻度变性等病理学变化.结论:乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤等组织中表达X蛋白,部分转基因小鼠出现的皮肤组织、肝组织和肺组织病理性损伤可能与X蛋白有关;各代转基因小鼠肝细胞中X蛋白的分布具有规律性的变化,可用于研究X蛋白在不同部位发挥功能的途径.
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乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性
目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒(HBV)X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系.方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象,20例HBV相关性肝细胞癌作为对照;HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序.免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量.结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87(nt1632、1633)、88(nt1635、1636)、116(nt1719)、118(nt1726、1727)、119(nt1730)、127(nt1752)、130(nt1762)和131(nt1764)位氨基酸.nt1725～1730(aa118/119)突变与肝组织内HBcAg显著低表达(P=0.006),和HBV DNA低拷贝数(P=0.004)明显相关,尤以ACTGAC(TD)型突变为明显;相反,nt1762/1764(aa130/131)位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达(P=0.005)和高水平的HBV DNA含量(P=0.006).同时,肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎(P＜0.05),而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高(P＜0.01).结论 肝组织内,在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平,nt1762/1764突变则相反.肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关.
