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HBx蛋白对人T细胞抗炎性细胞因子分泌的影响
目的 探讨HBx蛋白对人T细胞抗炎性细胞因子分泌的影响.方法 构建HBx蛋白的绿色荧光蛋白真核表达载体HBx-pEGFP-C1,双酶切(HindⅢ和Kpn Ⅰ)、DNA测序鉴定.利用脂质体转染技术将质粒HBx-pEGFP-C1瞬时转染人T细胞系Jurkat细胞株,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,RT-PCR方法检测X基因的表达情况.PHA(10 μg/ml)刺激活化预转染的Jurkat细胞6 h、24 h和48 h后,采用RTPCR技术在mRNA水平检测Jurkat细胞分泌IL-4、IL-10、IL-13和IL-14等抗炎性细胞因子的变化.结果 成功构建HBx-pEGFP-C1真核表达载体,并成功转染Jurkat细胞；与对照组相比,转染HBx蛋白组Jurkat细胞分泌IL-4、IL-10、IL-13和IL-14均明显降低(P＜0.05).结论 HBx蛋白即时高表达可降低人T细胞抗炎性细 胞因子的表达.
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HBx在乙肝相关性肝细胞癌中表达的意义及其对预后的影响
目的 探讨HBx蛋白在乙肝相关性肝细胞癌及癌旁组织中的表达,与相关临床因素间的关系.方法 通过Elivision二步法,检测40例根治性切除肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和癌旁组织中HBx表达,分析其与性别、年龄、TNM分期、HBV-DNA负荷、AFP、肝硬化、脉管侵犯、肿瘤淋巴细胞浸润(tumor lymphocyte infiltration,TIL)、Edmondson-Steiner病理分级及无瘤生存时间(tumor free survival time,DFS)的关系.结果 (1)肝癌组织和癌旁组织HBx表达比较,差异有统计意义(x2=10.026,P=0.002).(2)癌旁中HBx在HBV-DNA＜ 500 IU/ml和≥500 IU/ml比较,差异有统计学意义(x2=6.536,P=0.011);与年龄、性别、肝硬化及血清AFP相关不显著.(3)癌组织脉管侵犯和无侵犯的HBx表达比较,差异有统计意义(x2=5.079,P=0.037);与TNM分期、Edmondson-Steiner病理分级关系不显著.(4)癌旁组织中有TIL和少TIL的HBx表达比较,差异有统计意义(x2 =8.711,P=0.003),与DFS无明显相关;在癌组织DFS＜ 24个月和≥24个月组差异有统计意义(x2=6.857,P=0.009),与TIL无明显相关.结论 HBx在癌旁组织高表达,癌组织低表达,癌组织中高HBx表达可能预示预后较差,癌旁组织高表达可能预示预后较好.
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乙型肝炎病毒相关性肝癌发生的分子机制研究进展
原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是原发性肝癌发生和发展的主要的危险因素之一,因此深入研究乙肝相关性肝癌的发病机制成为一项长期而艰巨的任务,为肝癌的预防及合理治疗提供依据.本文将近年来乙肝相关性肝癌的分子机制做如下综述.
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截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立
目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响.方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,后通过RT-PCR和Wcsternblot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期.结果 (1)成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120.(2)成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系.(3)通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数(G2+S)明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞.结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBxMut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强.为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础.
关键词： HBx基因 HBx蛋白 C端截短型HBx突变体 HepG2细胞 -
HBx与microRNA-21在肝细胞肝癌中的相互作用及其机制研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因编码的X蛋白(HBx)与microRNA21(miR-21)在肝细胞癌HepG2细胞中的作用.方法:选取人肝癌细胞株HepG2细胞,随机分为HepG2细胞组、GFP腺病毒组和HBx腺病毒组,其中GFP腺病毒组和HBx腺病毒组细胞分别感染GFP腺病毒和HBx腺病毒,采用流式细胞仪检测各组细胞周期,Transwell检测细胞侵袭能力,Western blot检测ER蛋白表达,RT-PCR检测HBx mRNA和miR-21表达.结果:HBx腺病毒组HBx mRNA相对表达量为(0.805±0.030),明显高于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05);HBx腺病毒组细胞G1期比例为(34.24±2.10)％,明显低于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05),而S期细胞比例为(56.80±2.09)％,明显高于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05);HBx腺病毒组miR-21表达为(1.892±0.038),明显高于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05),而ERα蛋白表达为(0.21±0.03),明显低于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05);HBx腺病毒组穿膜细胞数为(78.12±8.78),明显高于HepG2细胞组和GFP腺病毒组(P<0.05).结论:HBx可促进肝癌细胞增殖及侵袭能力,其机制可能与上调miR-21表达和下调ER表达有关.
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乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体的检测及临床意义研究
目的 获得重组HBx蛋白,检测乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体并探讨其临床意义.方法 利用分子克隆技术克隆HBV X基因构建PET32a-HBX原核表达载体,表达和纯化HBx蛋白,用该重组蛋白建立检测抗-HBx抗体的间接ELISA方法;采用该ELISA分别检测正常人组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组患者血清中的抗-HBx抗体.结果 获得具有免疫原性的HBx融合蛋白;ELISA检测表明,慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体的水平均高于急性肝炎组,差异具有显著性;在这三组之间,慢性肝炎组高于肝硬化组和肝细胞癌组,差异具有显著性,肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体水平无显著性差异.结论 HBV患者血清中抗-HBX抗体是乙型肝炎病毒感染的一种特异性抗体,是HBV感染的血清学指标之一,可以反映乙型肝炎肝炎患者病情的变化.
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HBx基因真核表达载体的构建及表达
目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列；将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx)；再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子；脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列；双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确；转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.
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乙型肝炎病毒X蛋白与宿主细胞浆内蛋白质相互作用的研究
乙型肝炎病毒(HBV)的基因组结构紧凑,含有S、C、P、X 4个部分重叠的开放阅读框(ORF),其中小的开放阅读框是X基因,位于第1374～1836位核苷酸之间,编码的蛋白即HBx蛋白.HBx是一种功能复杂的蛋白,不仅存在于细胞核.也存在于细胞浆中.在细胞核中,HBx并不与双链DNA直接结-合,而是与转录因子和基本转录元件相互作用.介导转录起始复合物的形成,调节转录激活子的合成.目前研究发现,尽管在细胞核内存在HBx蛋白,但HBx蛋白的表达主要集中在细胞浆内.细胞浆中,HBx与多种蛋白质相互作用,影响HBV转录与复制及宿主细胞基因的转录、增殖、转化与凋亡等.
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乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞L02增殖及GSK3β表达的影响
目的:通过研究乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对人肝细胞株L02细胞增殖、细胞周期以及细胞中糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达的影响,探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性原发性肝细胞癌(hepatoccellular carcinoma,HCC)的发生机制.方法:用HBx腺病毒(Ad-HBx)感染人肝细胞株L02细胞后,RT-PCR法榆测L02细胞中HBx和GSK3β mRNA表达情况;MTT法检测L02细胞的增殖率变化;FCM法检测细胞周期中各时相所占比例:蛋白质印迹法检测HBx、总GSK3β(total-GSK3β,t-GSK3β)、磷酸化GSK3β(phospho-GSK3β,p-GSK3β)、β-连环素(β-catenin)以及细胞用期蛋白(cyclin D1)等蛋白的表达水平.结果:Ad-HBx感染L02细胞后,HBx的mRNA和蛋白均出现表达,细胞增殖率随着时间的延长而增加;G1期细胞所占比例较对照组减少,S期和G2期细胞比例较对照组增加(P<0.05).感染Ad-HBx后,t-GSKSp在mRNA和蛋白水平上均无明显变化,而p-GSK3β、β-catenin以及cyclin D1蛋白的表达量增加(P<0.05).结论:HBx可能通过促进人肝细胞株L02细胞中GSKap的磷酸化,激活Wnt/13-catenin下游信号通路,从而促进细胞的增殖.
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c-myc基因与乙型肝炎相关性肝细胞癌的关系
c-myc是一个在细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期中起重要作用的核内癌基因.c-myc借助c-fos经P38丝裂原蛋白激活酶(P38MAP)通路诱导细胞凋亡.WHV/HBV与细胞染色体整合可激活c-myc基因高表达,从而引起细胞过度增殖迅速形成肝肿瘤.HBx蛋白能够抑制c-myc经P38MAP通路诱导的凋亡.HBx蛋白与c-myc联合作用经人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverese transcriptase,hTERT)途径促进肝细胞癌(HCC)的发生.c-myc可能与HBV相关性HCC有关.
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稳定表达HBx的人肝星形细胞系的建立及其生物学特性初探
目的 建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的LX-2细胞系,并初步研究HBx对于肝星形细胞(HSC)的增殖及其Ⅰ型胶原蛋白表达的影响.方法 构建包含HBx基因的重组慢病毒载体LV5-X,并转染LX-2细胞,同时用对照质粒转染LX-2细胞,经嘌呤霉素筛选后获得HBx稳定表达的LX-2-X和对照LX-2-C细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,Western印迹检测细胞株中HBx的表达.在LX-2细胞系的生物学特性探索方面,应用CCK-8法检测细胞的增殖;Real-time PCR检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达;ELISA法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果 成功构建重组慢病载体LV5-X,感染LX-2细胞后建立细胞系LX-2-X和LX-2-C,嘌呤霉素筛选3d后,荧光显微镜显示近100％细胞发出绿色荧光,Western印迹证实LX-2-X细胞稳定表达HBx.培养72 h和96 h后LX-2-X细胞增殖明显高于LX-2和LX-2-C细胞组(P＜0.05);PCR证实LX-2-X细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA合成高于LX-2和LX-2-C细胞组(P＜0.05);ELISA结果显示LX-2-X细胞Ⅰ型胶原蛋白表达高于LX-2和LX-2-C细胞组(P＜0.05).结论 成功构建了稳定表达HBx的LX-2细胞系;HBx能够促进HSC的增殖,并增加Ⅰ型胶原蛋白的表达.
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慢性HBV感染肝组织的C端截短型HBx蛋白功能研究
[目的]探讨HBx突变体在肝细胞肝癌发病机制中的作用.[方法]收集慢性HBV感染者肝穿组织标本和HBV阳性的肝细胞肝癌组织标本.提取DNA.通过3D-PCR方法扩增HBx基因并测序检测HBx基因的突变.分析两种组织标本内HBx基因的突变模式,以及突变对HBx蛋白序列的影响.进而构建所检测到的HBx突变体的真核表达质粒,体外研究其生物学活性.[结果]在所检测的7例慢性HBV感染者肝穿标本内,有3例标本内检测到因G到A突变而产牛的C端截短型的HBx突变体.在所检测的2例HBV阳性的肝细胞肝癌组织内,也检测到相似的C端截短型HBx突变体.体外研究这种C端截短型HBx突变体的生物学功能发现其具有促进细胞增殖的功能.[结论]C端截短型HBx突变体在HBV相关的肝细胞肝癌发病机制中具有重要意义.
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乙肝相关肝细胞癌中HBx蛋白的作用机制
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(以下简称肝癌)是常见的恶性肿瘤之一,同时也是排列全球第三位的肿瘤相关致死原因.其发病率在我国仅次于肺癌,居第二位.我国每年约33万人死于肝癌,死亡率极高.另据统计,全球范围内约53％的肝癌病例与乙肝相关.同样有研究证明,乙肝病毒表面抗体(HBsAg)携带者相对于未感染者而言,其罹患肝癌的风险高出25 ～ 37倍.尽管大量证据已经证明乙肝是肝癌主要的病因之一,但是其慢性感染与肝癌的关联性尚存争议.
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HBx蛋白对α干扰素诱导的MxA蛋白表达的影响
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)HBx蛋白(Hepatitis B virus X protein)对α干扰素(IFN-α)诱导的抗病毒蛋白的影响及相关机制.方法 以表达HBx蛋白的重组质粒FL1-145HBx转染人肝胚瘤细胞株HepG2细胞,经IFN-α处理后,RT-PCR法分析细胞内抗病毒蛋白MxA和JAK-STAT信号转导途径分子STAT1 mRNA表达水平,同时运用免疫印迹检测细胞内HBx、p-ERK、p-STAT1和t-STAT1等蛋白的表达.结果 转染细胞内MxA、STAT1的mRNA和p-STAT1、t-STAT1的蛋白表达水平明显减少(P＜0.05);而ERK抑制剂PD98059预处理后,转染细胞内MxA、STAT1 mRNA水平能够恢复至转染前的表达水平.结论 HBx蛋白很可能通过影响IFN-α JAK-STAT信号转导途径分子而抑制抗病毒蛋白MxA的表达;ERK信号转导途径的活化可能参与这一抑制过程.
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HBV HBx基因荧光真核表达质粒的构建及其运用于HBV复制机制的初步研究
目的构建能够表达HBx蛋白的绿色增强荧光蛋白-HBx(pEGFP-N1-HBx)真核表达质粒,并探讨HBx蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法以HBV Dimer为模板,PCR法扩增HBx基因,PCR产物测序分析正确后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,命名为pEGFP-N1-HBx。将该质粒转染肝胚瘤细胞株HepG2,以RT-PCR法及荧光显微镜观察其表达情况,再通过基因共转染等技术研究 HBx 蛋白对HBV复制的影响。结果酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含HBx基因,RT-PCR法检测和荧光显微镜观察表明构建的pEGFP-N1-HBx 质粒在 HepG2细胞中能够表达；质粒pEGFP-N1-HBx与pHBV48-X0共转染后,HepG2细胞上清液HBV-DNA、HBsAg和HBeAg分泌显著增多。结论HBx基因克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-HBx构建成功；HBx蛋白能够促进HBV复制及抗原分泌。
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乙型肝炎病毒HBx的分子生物学研究进展
HBx是乙型肝炎病毒基因组编码的154个氨基酸组成的多肽蛋白，具有多种生物学活性，参与 HBV基因组的复制转录、宿主细胞基因转录、信号转导、细胞周期调控和细胞凋亡等调节，在 HBV复制感染、致肝病及肝癌的分子机制中起着关键作用。
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乙型肝炎病毒X基因的原核表达及血清抗HBx抗体的检测
目的应用表达蛋白检测乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体水平并探讨其临床意义.方法通过PCR扩增获得HBV X基因,与原核表达载体Pet32a+连接构建PET32a-HBX原核表达载体,转化E.coli BL21表达获得重组融合蛋白.经切胶透析纯化后,应用重组蛋白HBx建立检测血清中抗-HBx抗体的间接ELISA方法,分别检测正常人组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组患者血清中的抗-HBx抗体.结果获得具有免疫原性的HBx融合蛋白;ELISA检测表明,慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体的水平均高于急性肝炎组,差异具有显著性;在三组之间,慢性肝炎组高于肝硬化组和肝细胞癌组,差异具有显著性,肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体水平无显著性差异.结论HBV患者血清中抗-HBX抗体是乙型肝炎病毒感染的一种特异性抗体,是HBV感染的血清学指标之一,可以反映乙型肝炎肝炎患者病情的变化.
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HBx对感染细胞信号通路的调控及其与肝癌的发生
乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子.同时,HBx通过与宿主功能蛋白直接或间接地相互作用而调节多种蛋白的功能,参与调控多条细胞信号通路转导,激活多种转录因子,在肝细胞抗凋亡和引发肝癌的过程中起重要作用.
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重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究
目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列(1～154氨基酸)和截短序列(48～104氨基酸,48～146氨基酸,98～146氨基酸),将这几种不同长度和位置的HBX DNA序列克隆到pGEX4T-2原核表达载体中,并通过下游引物设计中引入6×组氨酸标签序列.结果 终成功构建N端融合GST蛋白标签序列和C端融合6×组氨酸标签序列的4种HBx重组表达载体.将4种包含不同长度HBx的重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,培养至菌液浓度A值大约0.6左右,加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.提取全菌蛋白通过Western印迹对HBx各重组蛋白产物的N端和C端进行检测.结论 在分段表达的HBx重组蛋白中发生了多处局部的断裂,而断裂部位主要集中于GST蛋白上.而造成这一结果的原因可能与HBx蛋白功能区域暴露后与GST相互作用有关.
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HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用
运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上.重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后, IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清.重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Western blot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达.通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍.通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1 mRNA发生了剪切.因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础.
