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RT-LAMP快速检测Norwalk病毒GⅡ型
建立一种检测Norwalk病毒GⅡ型快速、敏感的一步逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription-loop-me-diated isothermal amplification,RT-LAMP)方法.针对Norwalk病毒RNA聚合酶基冈特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,65℃保温约120 min,完成对Norwalk病毒GⅡ的扩增,扩增产物通过肉眼观察、SYBR GreenⅠ染色、凝胶电泳及酶切消化进行鉴定.利用RT-LAMP和RT-PCR方法同时检测48份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本来验证RT-LAMP方法的特异性;将Norwalk病毒GⅠⅡ RNA一系列稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感性.46份Norwalk病毒GⅠⅡ粪便标本出现LAMP扩增反应:通过肉眼观察、SYBR Green Ⅰ染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,LAMP产物的特异性通过酶切消化加以证实;2份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本未出现RT-LAMP扩增.RT-LAMP与RT-PCR特异性符合率为100%,RT-LAMP和RT-PCR检测Norwalk病毒GⅡ的检测下限均为15.6pg/管.与RT-PCR相比较,一步RT-LAMP法检测粪便中Norwalk病毒GⅡ的方法是一种快速、敏感、特异且准确的方法,有望用于快速检测感染性腹泻暴发时粪便中的Norwalk病毒GⅡ.
关键词： 逆转录环介导等温扩增 Norwalk病毒GⅡ RNA聚合酶 检测 -
蝙蝠甲型流感病毒H17N10新亚型的研究进展
2012年研究人员在蝙蝠中发现了甲型流感病毒H17N10新亚型.蛋白序列及结构分析显示,HA17蛋白及NA10蛋白与已知的甲型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶不同,它们不能与唾液酸结合,表明H17N10亚型病毒的HA17蛋白及NA10蛋白可能具有新功能.本文将扼要介绍有关蝙蝠甲型流感病毒H17N10亚型的研究进展.
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利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达
将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.
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草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达
草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)为我国分离、鉴定的第一株水生动物病毒.1983年,我国首次报道引起爆发性草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒[1,2],其后相继进行了系统的病毒形态学、生物学、生物化学及分子生物学特性等研究[3-8].自1979年Meyers T R等报道从水生动物中分离出第一株呼肠孤样病毒,迄今国际上已分离鉴定40余种水生呼肠孤病毒(aquareovirus).在这些分离株中,大多数毒株不能引起寄主的病理反应或仅表现出较弱的致病性.然而研究认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病力强的毒株[9].可见,以GCRV为模型,研究水生呼肠孤病毒的复制与致病机理具有一定的理论及实际意义.我们在对GCRV反应核心及体外转录研究中,已证实GCRV RNA聚合酶在病毒粒子中的存在及其位置[5];GCRV序列测定及定位结果显示,GCRV-VP2多肽为该病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase RdRp)[6,7].为了探讨草鱼呼肠孤病毒的侵染与宿主的相关性及复制机制,我们首次进行了该病毒RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究,并得到高效表达融合蛋白.这一结果将为该酶的活性及特性分析提供实验依据.下面报道本研究结果.
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抗流感病毒药物靶标研究进展
随着流感病毒的加速变异及不同亚型病毒在物种间重组概率的增加,流感作为世界范围的季节性流行性传染性疾病,对人类健康的威胁正日益增加和严峻.由于特异性疫苗研发的相对滞后性,全新机制的抗流感药物始终是有效对抗流感、保障人类健康的第一道防线.人类对流感病毒感染及增殖机制的认识,使现代抗流感药物的研究得到空前的推动.本文介绍了抗流感药物主要靶标的研究进展,以期为流感防治药物的研发提供借鉴.
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以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗病毒药物筛选和药效学评价方法的建立
流感病毒RNA聚合酶对流感病毒基因组的复制和表达至关重要.编码聚合酶各亚基的基因序列高度保守的特点使其成为极具发展潜力的抗流感药物靶标.本研究通过构建流感病毒RNA聚合酶活性依赖的荧光素酶报告系统,在细胞水平上建立了以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗流感药物筛选模型.特异性评价和统计学分析表明,该筛选方法灵敏可靠、重复性好,可以用于针对流感病毒RNA聚合酶的抗流感药物筛选.
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流感病毒聚合酶结构功能及其作为抗病毒靶点研究进展
流感病毒RNA聚合酶是由PB2,PB1,PA三个亚基组成的蛋白质复合物,分别由流感基因片段1,2,3编码.在流感病毒基因组RNA复制,病毒mRNA转录以及维持病毒生命周期中发挥着重要作用.近年来随着对其深入研究,为抗流感病毒药物的研制奠定了基础.本文主要介绍了RNA聚合酶各个亚基的结构、功能,亚基间相互作用以及RNA酶抑制剂的研究进展.
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动物组织线粒体DNA研究进展
线粒体基因组也叫线粒体DNA(mtDNA,Mitochondrial DNA),结构与细菌DNA相似,呈双链环状,可独立编码一些蛋白质,是核外遗传物质,人们在线粒体中已发现RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体等全套装备,说明线粒体具有独立的遗传体系.
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严重急性呼吸综合征及其实验室检查
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)或称非典型肺炎(atypical pneumonia,AP),在世界许多国家引起小规模暴发.SARS以其潜伏期短、发病急、病死率高对人类健康和生命安全造成严重的威胁.此次SARS的传播与人们对它的了解不足和重视不够有关,因此,通过这次人类与病毒的战争,我们应总结出一套针对传染病的行之有效的诊断、治疗方法,来预防和防止SARS的二次暴发.
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流感病毒RNA聚合酶抑制剂的研究进展
流行性感冒是由流感病毒引起的传染性疾病.流感病毒是一种RNA病毒,流感病毒RNA聚合酶是由PB1、PB2和PA 3个亚基构成的复合体,它们通过相互结合发挥功能,在流感病毒的转录复制过程中发挥着必不可少的作用.因此,如果能够抑制RNA聚合酶的PB1、PB2和PA亚基的生物活性,使其在病毒的转录和复制过程中失去活性,就能够达到抑制流感病毒的效果.本文对流感病毒RNA聚合酶抑制剂的研究进行综述,以期为抗流感病毒RNA聚合酶药物的设计提供参考.
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流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达
目的将流感病毒RNA聚合酶合酶PB1-1亚基进行亚克隆、表达,获得重组的亚克隆多肽,为进一步研究PB1亚基功能奠定基础.方法以PB1亚基cDNA为模板,用PCR方法扩增出PB1-1片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导各亚克隆系高效表达;优化表达条件.结果 PCR法扩增出487bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在E.coli M15中表达得到相对分子量约为20KD的重组蛋白,获得重组多肽.结论成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基.
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流感病毒RNA聚合酶的分离与纯化
目的建立分离、纯化流感病毒RNA聚合酶PB1、PB2和PA 3P蛋白的有效方法，为进一步研究3P蛋白的结构和功能奠定基础。方法用甘油、CsCl1及CsTFA不同介质的密度梯度超速离心法进行分离，用SDS－PAGE电泳及Western blot法检测3P蛋白，用尿素变性PAGE检测vRNA。结果用甘油密度梯度离心，可从病毒粒子中分离由NP、3P和RNA组成的RNP。将纯化的RNP用CsCl和甘油双组分不连续密度梯度离心，可形成NP和3P－RNA两部分，使NP与3P－RNA分离。进一步将3P－RNA在CsTFA－甘油双组分不连续密度梯度介质中进行超速离心，可有效地将3P与RNA分离，获得较纯的3P蛋白。3P位于离心管的上半部分，而RNA则位于离心管的近底端部分。结论用甘油、CsCl－甘油和CsTFA－甘油分步超离心法可有效地从流感病毒粒子中纯化出高纯度的流感病毒RNA聚合酶。
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白藜芦醇对呼吸道合胞病毒复制相关周期的影响
目的 研究白藜芦醇对呼吸道合胞病毒(RSV)感染Hep-2细胞相关周期的影响,并探讨金欣口服液(麻黄、苦杏仁、生石膏、葶苈子、桑白皮、前胡、黄芩、虎杖)治疗RSV肺炎的物质基础.方法 构建RSV感染Hep-2细胞体外模型,分为白藜芦醇处理组与未处理组,并以没有感染RSV的正常细胞作为对照组；采用体外转录法、荧光定量PCR法(qPCR)及激光扫描共聚焦显微镜法分别检测白藜芦醇对RSV的RNA聚合酶转录活性、核酸复制及诱导Hep-2细胞融合效应的影响.结果 白藜芦醇在25 μmol/L的大无毒浓度下,能显著抑制RSV的RNA聚合酶活性,但对RSV复制、融合蛋白F表达无明显作用,亦不能抑制RSV介导的细胞融合效应.结论 白藜芦醇在金欣口服液的抗RSV效应中发挥作用不是通过干预RSV复制相关周期,需要进一步研究.
关键词： 呼吸道合胞病毒(RSV) 白藜芦醇 RNA聚合酶 融合蛋白F -
基因转录与pre-mRNA剪接的偶联蛋白
真核基因的表达是一个复杂的过程,包括转录、pre-mRNA剪接、翻译等步骤.其中转录和pre-mRNA的剪接是基因表达中的两个重要环节,它们都要通过复杂的蛋白复合物来执行功能.目前研究发现这两个过程并不是绝对独立的,而是偶联在一起同时进行的.多种蛋白的偶联作用将二者联系在一起.RNA聚合酶Ⅱ、SKIP、SMN以及新近发现的人类P100蛋白不仅参与基因转录调节,同时它们在剪接加工中也具有相应的作用.
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RNA聚合酶II启动子shRNA表达载体构建的研究进展
一系列研究表明,一些小分子RNA操纵着许多细胞功能,它们通过互补序列的结合反作用于DNA,从而关闭或调节基因的表达.RNA是生物体内重要的物质基础之一,它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架.microRNA(miRNA, 即微小RNA) 可以通过与特定mRNA 结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因表达.
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草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化
草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属.序列分析表明,GCRV S2 片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa 的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质.为进一步了解该病毒 RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的 pR/RRpN及pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达.筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白.Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV-VP2血清呈阳性反应.通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白.上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据.
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A型流感病毒RNA聚合酶及其对基因组复制和转录的调控作用
A型流感病毒是正粘病毒科成员,为单股负链分节段RNA病毒,全基因组由八个节段组成,分别编码八种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2)和两种非结构蛋白(NS1和NS2).核蛋白(NP)和RNA聚合酶复合体与病毒的八个RNA节段组成八个螺旋丝状的病毒核衣壳(RNP),核衣壳被双层类脂膜包裹,脂膜内为基质蛋白(M1)层,膜上镶嵌着HA、NA和M2三种膜蛋白.HA和NA为流感病毒的主要抗原.根据HA和NA抗原性的差异,A型流感病毒可分16个HA亚型和9个NA亚型[1].A型流感病毒具有广泛的宿主范围和超强的重组变异能力,对人类健康的威胁日趋严重,引起各国政府和科技工作者的广泛关注.研究RNA聚合酶的功能、揭示病毒复制和变异机理是目前抗流感病毒感染研究的热点之一.本文综述了流感病毒RNA聚合酶及其对病毒基因组复制和转录调控的研究进展.
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细菌对利福平耐药机制研究进展
利福霉素为袢霉素类家族成员,可用于治疗多种感染,如结核病、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染、艰难梭菌引起的艰难梭菌相关性腹泻(Clos-tridiumdifficile-associated diarrhea,CDAD)、衣原体的持续感染[1]、旅行者腹泻[2]等.然而,利福霉素广泛用于临床感染治疗的同时,细菌耐药问题却使该杀菌"利器"变得"钝化".结核分枝杆菌极易对利福平(rifampin,RIF)耐药,约有3 .6% 新增结核病和20.2% 复治结核病为耐多药结核病[3].CDAD是成人医院获得性腹泻的主要原因[4],利福霉素类中利福昔明因其口服不易被吸收,用于治疗复发性CDAD[5],然而艰难梭菌对利福霉素耐药率高达11% [6].如何在正常发挥药物抗菌作用的同时减少细菌耐药的产生,关系临床抗感染治疗的成败.本文在介绍RIF抗菌机制的基础上,对细菌耐RIF的机制予以综述,为临床开发新的细菌转录抑制剂类药物提供帮助,以便更加有效的治疗感染.
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甲型流感病毒核糖核蛋白研究进展——抗病毒药物作用靶点新思路
甲型流感病毒的核蛋白、RNA聚合酶是其核糖核蛋白的重要组成部分,在病毒的生命周期中执行多种重要功能.随着研究的不断深入,核糖核蛋白已成为抗流感病毒药物的重要靶点.本文综述了甲型流感病毒核糖核蛋白主要组成部分的结构、功能,为抗流感病毒药物的研制提供了借鉴.
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4种水飞蓟素单体对鹅膏毒蕈中毒大鼠肝损伤的保护作用
目的 研究4种水飞蓟素单体对鹅膏毒蕈中毒所致的肝损伤保护作用.方法 选用60只大鼠,随机分为空白对照组、中毒模型组、水飞蓟宾组、异水飞蓟宾组、水飞蓟宁组及水飞蓟亭组6组(每组10只).除空白对照组外,其余5组给予鹅膏毒蕈造模后,给予相应药物,3d后观察大鼠存活情况,测定肝功能相关指标、肝细胞膜流动性及肝细胞RNA聚合酶活性.结果 与中毒模型组比较,4种水飞蓟素单体均能有效逆转鹅膏毒蕈中毒所致的肝功能指标异常,使之恢复正常(P＜0.01);均能稳定肝细胞膜的流动性(P＜0.01),同时能升高由于鹅膏毒蕈中毒引起的RNA聚合酶活性降低(P＜0.01).其中,水飞蓟宾的效果优于其余3种单体(P＜0.05).结论 4种水飞蓟素单体成分对鹅膏毒蕈所致肝损伤均具有保护作用,其中水飞蓟宾的活性高;改善抗氧化活性、稳定膜流动性以及提高RNA聚合酶活性是其实现对大鼠肝损伤保护的作用机制之一.
