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狼疮性肾炎治疗现状
霉酚酸酯(骁悉):是霉酚酸的前体,霉酚酸可以抑制腺苷单磷酸脱氢酶,减少DNA聚合酶的底物,从而抑制T细胞的增殖,其他细胞可通过补救途径合成嘌呤而不受影响.
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补肾益精方药对老龄大鼠不同脏器DNA聚合酶的影响
中医"肾精"与现代分子生物学中DNA功能极其相似,因此,补肾益精方药应对DNA合成、复制、损伤修复有一定的影响.本课题选用古典经方左归饮及自拟方益肾宝作为补肾益精方药,观察其对老龄大鼠不同脏器.DNA聚合酶活性的影响,探讨其延缓衰老的机理.
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EB病毒DNA聚合酶基因的表达与纯化及其在鼻咽癌病人诊断中的应用
以Epstein-Barr病毒(EBV)DNA聚合酶为抗原,建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法.构建原核表达载体pRSET-DNA聚合酶及其亚克隆pRSET-A1和pRSET-A2,在BL21(DE3)中表达的产物,经Western-blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)病人血清中的抗体.在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体,并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后2/3片段(A2)上.Western-bolt检测A2/IgG抗体的敏感性和特异性分别为80%和100%.对46份NPC病人血清和46份非NPC头颈癌症病人血清,用ELISA检测A2/IgA,敏感度为89%,特异度为93%.初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2/IgG抗体的方法,获得较高的敏感性和特异性.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α-干扰素机制初步探讨
目的 筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶N端257个氨基酸(TP257)相结合的抗α-干扰索(IFN-α)相关性肝细胞蛋白,初步探讨TP257抗IFN-α作用机制.方法 构建TP257腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并与腺病毒骨架载体pADEasy-1重组,以293A细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染Huh7细胞并以IFN-α诱导,收获细胞蛋白,Western blot验证TP257蛋白在细胞中的表达.细胞蛋白进行免疫沉淀,SDS-PAGE分离后通过质谱鉴定差异蛋白.结果 构建的重组腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7细胞并大量表达TP257蛋白.Huh7细胞感染AD-TP257后以IFN-α处理,并通过免疫沉淀筛选到4种差异蛋白,其中3种经肽质量指纹图谱鉴定分别为热休克蛋白60、组蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白调节轻链12A.结论 TP257抗IFN-α效应可能与它和特定肝细胞蛋白结合并相互作用有关.
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乙型肝炎病毒458 nt～1308 nt剪接特异性蛋白抗α-干扰素作用
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)458 nt～1308nt剪接特异性蛋白TSR'r'(源于HBVDNA聚合酶读码框,T代表TP区,S为Spacer区,R'为截短的RT区,r'为截短的RNaseH区)抗α-干扰素(IFN-α)作用并分析其功能区域.方法 PCR扩增获得HBV 458 nt～1308 nt剪接变异体剪接特异性基因TSR'r'及其缺失突变体,并克隆于pcDNA3.1/HisC.重组载体以FuGENE6转染Huh7肝细胞,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot检测目的蛋白表达.TSR'r'及其缺失突变体重组载体分别与IFN-α反应报告载体p6-16CAT共转染Huh7肝细胞,转染后48h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,检测胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)含量.所有实验数据采用单因素方差分析法进行统计分析.结果 构建TSR'r'及其缺失突变体重组真核表达载体,Westernblot显示各基因片段在Huh7细胞中均表达相应蛋白.p6-16CAT共转染结果显示,随着TSR'r'重组表达载体转染量的递增,Huh7胞内CAT值逐渐降低.此外,转染TP+Spacer区的缺失突变体可导致Huh7胞内CAT值显著下降,而其他各类TSR'r'缺失突变体共转染后胞内CAT值无变化.结论 HBV 458 nt-1308 nt剪接特异性蛋白抑制Huh7细胞对IFN-α仅的反应性,其活性与N端的TP及Spacer区有关.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析
目的 确定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干扰素(IFN-αt)的功能区域.方法 PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中,构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT.以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激,ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的表达,建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准.构建TP(包括Spacer区)基因缺失突变体重组真核表达载体,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达.重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用,并据此确定TP(包括Spacer区)抗IFN-α作用的功能区域.结果 获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT.转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强,且在IFN-α2a终浓度为100 IU/ml时达到大.Western blot显示TP(包括Spacer区)各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白.共转染p6-16CAT及部分/全长TP的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下,胞内CAT值和对照组相比无显著差别,相反,全长TP+部分/全长Spacer使细胞内CAT值显著下降.结论 DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关.
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不同DNA聚合酶对HBV PCR产物保真度的影响
PCR已广泛用于HBV感染标志物病毒DNA的定量检测~([1]),对PCR产物进行测序可分析HBV基因点突变,如检测拉夫米定等药物治疗诱导的与耐药相关的HBV基因点突变~([2-3]),研究乙型肝炎慢性化与转归的分子机制~([4]),分析基因多位点突变与HBV感染导致的肝细胞癌转移与复发的疾病预后的关系~([5]).PCR在HBV基因多位点突变的检测与研究中起重要作用.
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酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白
目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为HLA024AH.pGBKT7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.
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应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因
目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因.方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-DNAPTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索.
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胆囊良恶性病变组织中DNA聚合酶β(DNApolβ)和铁蛋白(FT)表达及临床意义
DNApolβ和FT与肿瘤发生、进展及预后等密切相关[1,2].作者应用EnvisionTM免疫组化法研究胆囊腺癌、慢性胆囊炎和胆囊结石组织DNApolβ和FT表达水平,探讨两者表达的临床病理意义.
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氧化苦参碱对HBV DNA聚合酶活性影响的体外研究
目的 观察氧化苦参碱对HBV DNA聚合酶活性的影响,探讨其抗HBV的可能机制.方法 从HepG2.2.15细胞培养上清液中获取HBV颗粒,以包括32P-dCTP在内的脱氧核酸作为底物,加入不同药物浓度的反应液,氧化苦参碱的浓度分别为1000 μg/ml、800 μg/ml、600 μg/ml、400 μg/ml和200 μg/ml,阿德福韦酯的浓度分别为100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg/ml、40 μg/ml和20 μg/ml,并设立空白对照组,每组3个复管.于37℃孵育过夜,蛋白酶K消化后每管取35 μl反应液点样于DE 81滤膜上,用液体闪烁测量仪测量掺入HBV DNA正链中的32P-dCTP的放射量.结果 与空白对照组相比,不同浓度的氧化苦参碱作用后,HBV DNA聚合酶活性维持在103%～107%;不同浓度的阿德福韦酯作用后,HBV DNA聚合酶活性维持在91%～102%之间.各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 氧化苦参碱在体外对HBV DNA聚合酶活性无直接抑制作用.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析
目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a(+)表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的亚细胞定位与结构预测
目的 利用真核细胞绿色荧光表达系统分析乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的亚细胞定位,并用生物信息学方法对其结构进行分析.方法 将HBVDNAPTP1基因片段插入pEGFP-C1载体中,分别转染HepG2细胞与CX3S7细胞,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光融合蛋白的细胞内定位,并应用生物信息学技术分析HBVDNAPTPl的结构特征.结果 经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的绿色荧光表达载体,转染细胞后,48～72h内细胞质出现明显的绿色荧光信号.结构预测结果表明HBVDNAPTPl无卷曲螺旋区域,有6个疏水区;无特殊二级结构,有2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点和3个蛋白激酶C磷酸化位点;不具有跨膜螺旋结构,无信号肽.结论 HSVDNAPTP1的亚细胞定位结果与生物信息学分析相符,为进一步研究其生物学功能及其在乙型肝炎、肝细胞癌中的作用机制奠定了基础.
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基于分子对接技术预测人面子叶中黄酮成分抗菌作用靶点
目的：木犀草素、槲皮素、儿茶素、表儿茶素是人面子叶中主要的黄酮成分，研究显示人面子具有抗菌活性，利用Autodock软件，模拟并预测黄酮成分的抗菌作用靶点。方法：采用中医药化学数据库和Autodock 4．2软件进行分子对接。结果：模拟分析得出木犀草素、槲皮素、儿茶素、表儿茶素与青霉素结合蛋白3、青霉素结合蛋白5、DNA聚合酶的对接结果及其功能区域的相互作用关系。结论：木犀草素是人面子叶中潜在活性成分，青霉素结合蛋白5和DNA聚合酶是人面子叶中黄酮成分抗菌的潜在靶点。本研究预测了人面子叶的抗菌作用靶点，为探索其抗菌机制奠定了基础，也为以木犀草素为先导化合物开发新型药物提供了理论基础。
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动物组织线粒体DNA研究进展
线粒体基因组也叫线粒体DNA(mtDNA,Mitochondrial DNA),结构与细菌DNA相似,呈双链环状,可独立编码一些蛋白质,是核外遗传物质,人们在线粒体中已发现RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体等全套装备,说明线粒体具有独立的遗传体系.
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POLι基因与肿瘤易感性的研究进展
POLι(Pol iota)基因是一种参与DNA损伤修复的基因,其编码产物是DNA聚合酶Y家族的成员,即DNA聚合酶ι,在DNA跨损伤合成中起重要作用.近年来研究发现POLι基因与某些肿瘤的发生和发展有关.本文对DNA聚合酶ι的基因定位、结构、功能、分子特性及其与肿瘤易感性的关系进行综述,旨在为探索肿瘤发生机制提供新的线索.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1基因全长cDNA RACE克隆
目的 利用eDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1基因的全长cDNA序列.方法 提取肝母细胞瘤细胞系HepG2总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)技术建立RACE cDNA文库,进行RACE实验,扩增HBVDNAPTP1基因全长cDNA序列.结果 经RACE实验,获得HBVDNAPTP1基因全长cDNA序列为2 537 bp,经RT-PCR验证确定该基因真实存在,且与GenBank数据库中注释的其他基因无同源性.结论 成功获取HBVDNAPTP1基因的全长cDNA序列,为进一步开展HBVDNAPTP1生物学功能及调控机制研究提供了线索和依据.
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DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价
目的 评估不同DNA聚合酶是否会对以16S rRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响.方法 用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFiTM HotStartDNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至“种”水平的测序分析.结果 经配对Mann-WhitneyU检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P＞0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异.经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P＞0.05).结论 KAPA HiFiTM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PaeBio SMRT测序结果.
关键词： DNA聚合酶 PacBio SMRT测序技术 肠道微生物 -
重组Thermus thermophilus DNA聚合酶表达纯化及其在RT-PCR中的应用
目的研究重组Thermus thermophilus DNA聚合酶的表达、纯化和应用.方法提取Thermus thermophilus hb8基因组DNA作为模板,PCR扩增Tth DNA聚合酶基因后,克隆至pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用His-Bind Quick Cartridge 300纯化重组Tth DNA聚合酶His-tag融合蛋白.提取Thermomonospora fusca总RNA,用一管法RT-PCR扩增E2 cd基因,检测重组Tth DNA聚合酶RT-PCR活性.结果大肠杆菌表达Tth DNA聚合酶,分离出的电泳纯重组Tth DNA聚合酶His-tag融合蛋白相对分子质量为94 000,表达产量为200 000 U/L.一管法RT-PCR可扩增出850 bp长度的E2 cd基因.结论重组Tth DNA聚合酶已成功地表达和纯化,并用于RT-PCR.
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DNA聚合酶中宿主细胞核酸残留的分析
目的 分析市售不同厂家DNA聚合酶中的宿主细胞核酸残留.方法 根据E coli 16S rRNA基因序列设计特异引物及探针,建立基于Taqman探针技术的Real-time PCR检测方法,检测基因工程制品中E.coli的核酸残留.结果 建立的Real-time PCR法检测市售不同厂家的DNA聚合酶中均有宿主细胞E.coli核酸残留,但不同来源的DNA聚合酶其宿主细胞核酸残留量不同.结论 应用PCR方法检测基因工程产品,尤其是E.coli制备的生物制品时,应注意DNA聚合酶中核酸残留对检测结果的影响;应用Real time PCR法定量检测时,建议将Ct值控制在30以内,以减小DNA聚合酶背景残留物的影响.
