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乙型肝炎的实验室检测及临床意义
乙肝是目前已确认的病毒性肝炎中对人类健康危害为严重的一种肝炎,1965年Bhumberg等首次发现乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg),HBV属于嗜肝DNA病毒科,完整的HBV病毒称为Dane颗粒,直径42nm,球形,有包膜(即HBsAg).患者血中除Dane颗粒外,还有16~25nm的球状和杆状体,是病毒组装过剩的HBsAg,HBV基因组由部分双链的环状DNA组成,长约3.2Kb,有4个开放读码框架,即S(包括前S1和前S2)、C(包括前C)、P和X4区HBV抗原.
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不同DNA聚合酶对HBV PCR产物保真度的影响
PCR已广泛用于HBV感染标志物病毒DNA的定量检测~([1]),对PCR产物进行测序可分析HBV基因点突变,如检测拉夫米定等药物治疗诱导的与耐药相关的HBV基因点突变~([2-3]),研究乙型肝炎慢性化与转归的分子机制~([4]),分析基因多位点突变与HBV感染导致的肝细胞癌转移与复发的疾病预后的关系~([5]).PCR在HBV基因多位点突变的检测与研究中起重要作用.
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HBV基因多态性研究进展
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)分子生物学的研究早要追溯到1965年,Blumberg等先在澳大利亚土著人血清中发现了乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg),这是人类首次检测到肝炎病毒抗原,当时称"澳抗".在长期的生存中,由于基因突变现象的不断累积,原有HBV可能发展成核酸成分差别很大的病毒,以至造成核酸成分的显著差别,终逐渐形成不同的基因型.如果某些核酸序列位点的改变导致其编码产物抗原位点的改变,就逐渐构成了不同的血清型.
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HBV基因组与变异
一、HBV基因组结构人HBV属于嗜肝DNA病毒的一种.完整的HBV长度在3 182~3 221个核苷酸,HBV是环状部分双链结构DNA.其中负链完整,末端有8~9个碱基的冗长序列,并形成该部分三链结构;正链不完整,有固定的5'端,但3'端位置不确定.
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全基因组分析乙型肝炎病毒缺失变异及其与干扰素疗效的关系
干扰素是治疗慢性乙型肝炎(CHB)的主要药物之一,但其有效率仅为20%~40%[1-3].研究显示,HBV一些特定位点的变异具有抵抗干扰素的作用,这些位点的变异虽然可以抵抗干扰素的作用,但不足以说明干扰素抵抗的机制.目前大多数研究是以HBV的部分片段或特定位点作为研究对象,并不能反映患者体内病毒的真实状态,具有一定的局限性.为进一步了解HBV的生物学特性对干扰素疗效的影响,本研究采用全基因克隆的方法[4]从CHB患者血清中扩增HBV全基因组DNA,分离检测HBV基因组缺失突变体,分析HBV变异与干扰素疗效之间的关系.
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乙型肝炎病毒X基因突变与疾病进展的相关性
HBV基因组负链碱基序列至少包含4个开放读码框(ORF):S、P、C和X.其中,HBV X基因位于第1374~1838位核苷酸(nt),长约465个碱基,是HBV基因组内结构和功能重叠明显的区域,包含增强子2、C基因启动子、直接重复序列1(DR1)和直接重复序列2(DR2),这些区段在HBV基因的复制、转录调节及表达中具有重要作用[1].目前,HBV慢性感染者疾病不同转归的机制尚不明确.
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核苷(酸)类似物耐药与乙型肝炎病毒表面抗原变异
HBsAg变异是HBV研究的热点之一,但既往研究主要关注HBsAg变异与疫苗-乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)逃逸、HBsAg 诊断试剂以及隐匿性HBV感染的关系等[1].实际上,在HBV基因组中,HBsAg的编码序列与反转录酶(Rt)的编码序列完全重叠,因此Rt变异有可能造成HBsAg的相应变异.随着核苷(酸)类似物(NA)在慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治疗中的不断推广,NA治疗相关的Rt变异也日益增加.部分NA相关Rt变异会导致HBsAg的相应变异,并使其功能发生改变;另外,部分HBsAg变异也可导致Rt相应变异及功能改变.现就该研究方向的进展综述如下.
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乙型肝炎病毒基因分型的研究进展
自从1988年Okamoto等首次根据组间全基因序列差异≥8%对HBV进行基因分型以来,对HBV基因分型方法学上的改进、和其所存在的地域性、民族特异性、以及它的临床意义都展开了大量研究,这对从分子水平阐明不同基因型的流行势态,和对其病因学的研究,加强对HBV的防治有重要意义.基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点,是病毒变异进化的结果,对其分型标准的依据是全基因序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%.大量HBV序列分析工作提示S基因序列稳定,不同基因型各开放读框中S基因异质性大,而同一基因型中的各毒株S基因异质性小,因而S基因适于基因型分型.目前HBV基因型分型方法学有4种,可将其分为A、B、C、D、E、F、G等7种.其分型方法包括1、全基因或S基因测序法,该方法是鉴定基因型的金标准,但工作量大.2、Lindh等创立的S基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法,可鉴定89%的基因型,国内文献[1]报道对PCR-RFLP方法进行了改进,可鉴定95%以上的标本,但PCR-PFLP分型法所需时间较长、步骤较多,且遇到混合感染或酶切不完全,就会出现复杂带型,因此目前建立的PCR-PFLP分型方法都不能鉴定100%的标本.3、多引物PCR分型方法[2],它是在对114例HBV全序列进行充分比较分析的基础上,找出每种基因型相对于其他各种基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出6对分别针对性A-F型的诊断引物,利用其仅需一次PCR可得出分型结果,理论上能鉴定100%的标本.4、单克隆抗体酶联免疫吸附法,该方法虽然简便,但要建立一套单克隆抗体则较为困难,且难以从基因水平上对HBV进行分型.HBV的基因型分布在不同地理区域有不同的特点.
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乙型肝炎病毒前C区及BCP区变异的临床意义
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的全球性疾病.据报道,目前全球慢性HBV感染者达3.5亿人,大约每年100万的患者死于肝衰竭、肝硬化,并有可能进展为肝细胞癌[1].机体感染HBV后临床表现各不相同,至今仍缺乏有效控制,造成这一局面的原因很多,其中HBV基因组变异可能是重要原因.本文就乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子(BCP)区突变与临床的关系做一综述.
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乙型肝炎标志物及其临床意义
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起危害严重的病毒性肝炎.HBV属嗜肝DNA病毒族,HBV基因组是一个大约3 200个碱基的部分双链环形DNA,其负链核苷酸序列有4个开放读码框,S,P,C,X基因区.S基因可分前S1基因,前S2基因和S基因;C基因可分为前C基因和C基因;P基因编码DNA聚合酶;X基因编码的蛋白具有调节病毒复制等功能.我国有约10%的人群感染乙肝,而乙肝标志物的检测对乙肝的临床诊断、治疗和预防具有重要意义.本文就乙肝标志物与其近来在临床应用等方面的研究进行综述.
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对检测乙型肝炎方法的研究
血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)是HBV感染的直接证据,是反映体内病毒复制的主要指标,在乙型肝炎传染性的判断、抗病毒药物疗效评价和监测中有着重要意义.临床常用检测HBV DNA技术有普通聚合酶链式反应(C-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR) 技术.我们用C-PCR和FQ-PCR分别检测249例乙型肝炎患者的血清HBV DNA,并用ELISA检测了HBV血清标志物,比较了不同HBV血清标志物阳性标本的2种HBV DNA检测结果以及HBV基因组在血清中的荧光波长阈值,并探讨C-PCR和FQ-PCR的临床应用价值.
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人精子携带的HBs和HBc基因在早期胚胎细胞中的蛋白表达
背景与目的:探讨由人精子带入受精卵中的HBs和HBc基因能否在早期胚胎细胞中进行蛋白表达.材料与方法:人精子经重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染后,与金黄地鼠去透明带卵母细胞离体受精,选择带绿色荧光的2-细胞胚,用免疫荧光技术检测HBs和HBc基因在胚胎细胞中的蛋白表达,用ELISA方法分别对HBsAg和HBcAg进行半定量和定性分析.结果:在带绿色荧光的2-细胞胚中免疫荧光检测可见清楚的HBsAg和HBcAg阳性信号;ELISA结果表明,单个2-细胞胚内HBsAg的量小于0.064 ng/ml,对HBcAg的检测得到阳性结果.结论:人精子携带到卵内的HBV基因可在早期胚胎细胞中表达表面抗原和核心抗原.