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间隔区寡聚核甘酸分型技术(spoligotyping)的建立及其对结核分支杆菌菌株北京基因型的初步鉴定
目的:建立一种以PCR为基础的结核分支杆菌DNA指纹技术,即间隔区寡聚核甘酸分型技术(Spoligotyping),研究该方法在结核分支杆菌北京基因型鉴定中的应用,并探讨该方法在结核分支杆菌流行病学中的应用.
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铜绿假单胞菌产TEM-147型ESBL基因的克隆及原核表达
到2006年为止,伞球范围内发现的超广谱β内酰胺酶(ESBIs)已有200多种,其中TEM型有百余种.世界各地TEM型β内酰胺酶的流行状况各不相同.在我国,已相继报道了TEM-10、TEM-104、TEM-105、TEM-128、TEM-129、TEM-28、TEM-29、TEM-19和TEM-116型β内酰胺酶[1-8].近我们在研究川北医学院附属医院铜绿假单胞菌耐药机制时发现了TEM-147,这是一种新的TEM基因亚型(GenBank注册号:DQ279850).为了解TEM-147的特性,本研究对TEM-147编码基因进行克隆、测序、基因型鉴定和原核表达,现将结果报道如下.
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聚合酶链反应-单链构象的多态性技术鉴定解脲脲原体生物群和基因型鉴定中的应用
本研究通过对解脲脲原体(UU)的14个标准血清型的聚合酶链反应-单链构象的多态性(PCR-SSCP)电泳分析,直接鉴定UU生物群和基因型.
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新疆维吾尔族脂质代谢紊乱与SOCS3基因变异的相关性
目的：探讨新疆维吾尔族脂质代谢紊乱与SOCS3基因变异是否具有相关性。
方法：经流行病学现况调查所收集的2007年1月至3月新疆和田地区30至70岁，三代无异族通婚史、无近亲结婚史的1379例新疆维吾尔族人群作为研究对象。其中，脂质代谢紊乱组909例，对照组470例。对所有研究对象进行问卷调查、体格检查。同时，采集研究对象素食及禁酒一日、禁食水12 h的第四日清晨的坐位空腹肘静脉血，低速离心30 min，分离血浆及血细胞并放于-20℃冰箱保存。血浆用于生化指标的同批次检测，血细胞通过应用DNA试剂盒提取DNA，并于-80℃低温保存。应用相关软件，参考文献，选取Tag SNPs，应用TaqMaq-PCR技术进行基因型鉴定，并开展病例-对照关联研究。 -
经基因型鉴定确诊为Gilbert综合征一例报道及文献复习
Gilbert综合征(Gilbert syndrome,GS)是一种常见的胆红素代谢紊乱性常染色体遗传病,其发病机制主要为编码尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase,UGT)的UGT1A1基因启动子和外显子发生突变,致间接胆红素(indirect bilirubin,IB)葡萄糖醛酸化过程障碍而发病.由于多数患者仅表现为慢性轻度升高的间接胆红素血症,临床症状轻微,造成临床诊断时程较长,若合并肝炎病毒感染,则更加难以诊断,我国大多数医院受实验室条件限制,难以排除类似疾病,现对本科近期收治的1例GS患者的临床资料进行总结,并结合文献探讨GS的临床特点、诊断及治疗等.
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Pumilio1/Pumilio2双基因条件性敲除小鼠模型的建立及基因型鉴定
目的 建立及鉴定Pumilio1/Pumilio2(Pum1和Pum2)双基因条件性敲除的小鼠模型,为进一步研究PUF家族在哺乳动物精子发生中的生物学功能奠定基础.方法 将构建的Pum1条件性敲除和Pum2条件性敲除的两个品系小鼠进行交配并繁殖,终繁殖成功的子代小仔Pum1和Pum2两个基因均为纯合子.对子代以剪趾方式进行编号,提取子代小鼠脚趾或鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型.结果 Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型繁殖成功,同时获得更多PUF家族双基因条件性敲除的小鼠.结论 成功建立了Pum1和Pum2双基因条件性敲除的小鼠模型;正确的交配繁殖策略和鉴定方法是获得PUF家族双基因条件性敲除小鼠的有效途径.
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ApoE-/-小鼠的繁殖与鉴定
目的 繁殖和鉴定ApoE-/-小鼠,建立血管损伤模型,为进一步研究动脉粥样硬化奠定基础.方法 将引进的小鼠采用1只雌性与1只雄性同笼的方式进行繁殖.从子代小鼠尾巴中提取DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳法鉴定小鼠的基因型.获取ApoE-/-纯合子小鼠,并绘制其0～20周龄生长曲线.采用油红O脂类染色法从血管形态学方面观察ApoE-/-小鼠.结果 成功繁育出的ApoE-/-纯合小鼠较C57小鼠生长缓慢,且20周龄ApoE-/-小鼠血管有明显损伤.结论 利用ApoE-/-纯合子小鼠能够建立良好的血管损伤模型.
关键词： 载脂蛋白E-/-小鼠 基因型鉴定 -
介绍一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的改良方法
目的 建立一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的简便方法.方法 先对胎鼠组织进行碱裂解,然后通过盐析纯化DNA,经琼脂糖凝胶电泳判断DNA大小,检测A260/A280的比值判断其纯度,后将抽提的DNA进行PCR扩增和基因型分析,检测其作为PCR模板的稳定性.结果 在2h内能分离到胎鼠基因组DNA,片段完整没有明显的降解现象,A260/A280比值＞1.77,能稳定用于PCR基因型鉴定分析.结论 该方法简便、快速、经济,能得到PCR级的高质量胎鼠基因组DNA,为准确和快速地进行胎鼠的基因型分析提供保证,具有很好的稳定性、可靠性和实用性.
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模式小鼠总 DNA 三种提取方法比较
目的：建立简便、快捷、经济的模式小鼠总DNA提取方法，以快速鉴定大批量模式小鼠基因型。方法采用苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法提取同种模式小鼠总DNA，对比DNA纯度、得率、耗费时间，并比较基因型鉴定结果。结果苯酚抽提法得率高，异丙醇沉淀法低；而纯度则按照苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法顺序递减；在耗时上鼠耳煮沸法短。三种方法提取的DNA均可做模版用于基因型鉴定。结论鼠耳煮沸法操作简单、成本低，快速、基因型鉴定结果可靠，可用于规模化的基因型鉴定实验中。
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UCH-L1基因敲除小鼠的饲养、繁殖及鉴定
目的 饲养、繁殖和鉴定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)基因敲除小鼠,获得UCH-L1基因敲除纯合子小鼠,为深入研究UCH-L1的生物学功能奠定基础.方法 从美国购进的UCH-L1基因敲除小鼠经适应性饲养1周后,将1只雌性杂合子和1只雄性杂合子小鼠合笼饲养并繁殖,剪取子代小鼠尾尖部0.5 cm组织,提取基因组DNA,PCR方法鉴定其基因型.雄性杂合子与雌性杂合子交配生产后代中,野生型和UCH-L1基因敲除纯合子小鼠用于后续的生物学功能研究;杂合子小鼠用于繁殖.观察UCH-L1基因敲除纯合子小鼠的表型变化,并利用免疫印迹法验证UCH-L1基因敲除的效果.结果 小鼠成功繁殖后,利用杂合子交配共生产370只小鼠,其中UCH-L1+/+占34.1％、UCH-L1+/-占50.5％、UCH-L1-/-占15.4％,成功获得UCH-L1基因敲除纯合子小鼠,并建立了饲养、繁殖和鉴定方法.结论 采用雌性和雄性UCH-L1基因敲除杂合子小鼠交配,不仅可以获得UCH-L1基因敲除纯合子小鼠,而且有利于长期饲养与繁殖.
关键词： 泛素羧基末端水解酶L1 基因敲除小鼠 基因型鉴定 -
广西柳州市血红蛋白H病的分子流行病学和血液学研究
血红蛋白H病(HbH病)属中间型α地中海贫血(α地贫),也是我国南方地贫高发区常见的溶血性贫血,其表型特征是电泳时可在患者的外周血中检出HbH带[1].在各类α地贫中, HbH病的基因缺陷背景为丰富,故是研究α地贫的分子病理学的良好材料.HbH病的临床表现差异很大,从基因型和表型关系入手探讨其病因学对遗传咨询和临床实践有指导作用.我们首先在大样本系统筛查基础上,调查了广西柳州市城镇人群的分子流行病学及其基因构成情况,并对该地3组不同来源 (群体筛查、门诊和住院病例) 的104例HbH病患者进行了基因型鉴定及血液学表型分析.
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白细胞介素1受体1和白细胞介素6双基因敲除小鼠的构建及基因型鉴定
目的 通过白细胞介素1受体1 (interleukin-1 receptor1,IL-1R1)和白细胞介素6 (inter-leukin-6,IL-6)单基因敲除小鼠杂交繁育以获得IL-1R1-/-IL-6-/-纯合子小鼠.方法 将IL-1R1 +/+IL-6-/-和IL-1R1-/-IL-6 +/+小鼠杂交,并进行子代自交繁殖,提取基因组DNA,PCR鉴定其自交子代基因型.并用免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)确定自交小鼠后代基因型.结果 PCR鉴定成功获得基因型为IL-1R1-/-IL-6-/-的双基因敲除小鼠.Western blot结果显示,双基因敲除小鼠未见IL-1R1的蛋白条带;ELISA结果提示,双基因敲除小鼠的IL-6细胞因子为阴性.结论 成功获得IL-1R1-/-IL-6-/-双基因敲除纯合小鼠,为深入研究IL-1R1、IL-6基因相关的炎症疾病动物模型奠定基础.
关键词： 白细胞介素-1受体1 白细胞介素-6 基因敲除小鼠 基因型鉴定 -
DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定
目的:探讨盘状结构域受体2(DDR2)基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础.方法:将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型.用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性.结果:DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力.依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性.结论:雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠；实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型.
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SPARC基因敲除小鼠的繁育及子代基因型的鉴定
目的:探讨富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)基因敲除小鼠的繁殖和鉴定方法,为进一步研究SPARC蛋白的功能奠定基础.方法:将所引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型.提取子鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法扩增SPARC和Neo基因片段,通过限制性内切酶酶切反应,证实PCR扩增产物的正确性;应用Western blot检测SPARC蛋白质的表达,进一步证实PCR鉴定方法的可靠性.结果:SPARC基因杂合子小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,SPARC基因缺失纯合子小鼠有繁殖能力.琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物分子量大小与预期的目的基因片段相对分子质量大小一致,酶切和Western blot结果证实PCR结果可靠.结论:PCR方法能够准确鉴定SPARC基因突变小鼠基因型.
关键词： 富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白 基因敲除 基因型鉴定 -
钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb／C小鼠的繁育及鉴定
目的：建立钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin ，CAST）基因过表达Balb／C小鼠的培育方法，并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法：将雄性C57BL／6‐CAST＋／－转基因小鼠与雌性Balb／C野生型小鼠杂交，将雄性CAST＋／－杂合子代小鼠与雌性Balb／C野生型子代小鼠杂交，连续杂交至消除C57BL／6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织，采用碱性裂解液提取基因组 DNA ，PCR法扩增 CAST 基因片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒（CVB3）感染Balb／C‐CAST －／－小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果：C57BL／6‐CAST＋／－转基因小鼠与雌性Balb／C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL／6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要，且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb／C‐CAST －／－基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论：成功建立Balb／C‐CAST基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效，值得推广。
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TEM-104编码基因的克隆与原核表达
随着超广谱β-内酰胺类抗生素(如头孢噻肟、氨曲南和头孢他啶)在临床上的应用,首先在肠杆菌科细菌中发现了超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),其由肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌和铜绿假单胞菌等产生[1],且能使第3代头孢菌素和单环类抗生素失活.截止2001年12月12日,在全球范围内至少已发现150多种ESBLs.根据其编码基因同源性的不同分为TEM、SHV、CTX-M、OXA和其他等五类,其中以TEM和SHV型多见,他们分别由广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1编码基因中数个位点发生点突变而来.各国各地区流行的ESBLs基因型各不相同.我们对浙江地区临床分离的4株肺炎克雷伯菌和5株大肠埃希菌所产ESBLs编码基因进行克隆、序列分析、基因型鉴定和原核表达,结果如下.
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大/小鼠组织DNA两种提取方法的比较
目的 获取质量稳定的基因组DNA,快速鉴定模型动物基因型.方法 以鼠尾组织为实验材料,采用苯酚/氯仿法和改良煮沸法提取鼠基因组DNA;分别用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,采用PCR检测两种方法获得DNA的扩增效果.结果 酚/氯仿提取法提取的基因组DNA质量优于改良煮沸法,但两种方法获得的DNA模板均能成功应用PCR扩增进行基因型鉴定,且改良煮沸法DNA提取具有无毒、简单、高效、便捷的优点.结论 大批量转基因大/小鼠基因型鉴定可以优先选择改良煮沸法提取基因组DNA.
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PCR和限制性内切酶在uPA-SCID小鼠基因型鉴定中的应用
目的 建立一种简便、快捷、准确的基因型鉴定方法用于uPA-SCID小鼠的基因型鉴定.方法 应用PCR技术与限制性内切酶相结合的方法检测uPA-SCID小鼠的基因型.结果 uPASCID小鼠的uPA基因型鉴定结果显示:uPA基因野生型在153 bp有条带,纯合子在337 bp有条带,杂合子在337bp、153bp有条带.uPA-SCID小鼠的SCID基因型鉴定结果显示:uPA-SCID小鼠SCID基因突变体在38 bp、26 bp有条带,杂合子在64 bp、38 bp、26 bp有条带,野生型在64 bp有条带.结论 建立的基因型鉴定方法简便易行、可靠,通过该方法可以确定uPA-SCID小鼠的基因型,筛选出需要的纯合子uPA-SCID小鼠.
关键词： uPA-SCID小鼠 基因型鉴定 聚合酶链反应(PCR) 限制性内切酶 -
BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定
目的 探讨BAMBI-/-小鼠的繁殖和鉴定方法,筛选出足够数量的BAMBI-/-小鼠,为研究BAMBI基因在肥胖、能量代谢等方面的生理功能提供实验动物.方法 将引进的2对BAMBI-/-小鼠扩繁后,以与背景品系C57BL/6J野生型(WT)回交的方式获得BAMBI+/-小鼠,再将BAMBI+/-小鼠进行互交大量繁殖.提取幼鼠尾部组织DNA,利用PCR方法鉴定基因型;选取BAMBI-/-小鼠取肩胛部位棕色脂肪组织(BAT),腹股沟部位皮下白色脂肪组织(sWAT),性腺周围白色脂肪组织(gWAT)和肝脏,利用实时PCR方法检测BAMBI mRNA的表达量.结果 BAMBI+/-小鼠互交扩繁,短期能获得大量小鼠;C57BL/6J野生型(WT)、BAMBI+/-和BAMBI-/-各表型结果基本符合孟德尔遗传规律;BAMBI-/-小鼠敲除效率理想.结论 BAMBI+/-小鼠互交是繁育BAMBI-/-小鼠的较好方法;PCR方法能够准确鉴定BAMBI-/-小鼠.
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Cx43基因条件敲除小鼠的繁殖、基因型鉴定和骨髓检测
目的 探讨连接蛋白43(Cx43)基因条件敲除小鼠(Cx43KO小鼠)的繁殖、基因型鉴定及其导致的骨髓增生异常机制.方法 将引进的2对转基因小鼠Cx43loxP/loxP和Lyz-Cre/+进行交配饲养和繁殖,选取子一代雌性Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+与雄性Cx43loxP/loxP合笼交配,获得Cx43loxP/loxP_Lyz-Cre/+小鼠(即Cx43KO小鼠).提取鼠尾组织基因组DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,RT-PCR方法进一步验证Cx43KO小鼠的正确性.结果 Cx43KO小鼠繁殖成功,成功获得Cx43loxP/loxP_Lyz-Cre/+、Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+、Cx43loxP/loxP、Cx43loxP/-四种基因型小鼠;其繁殖结果符合孟德尔遗传定律.Cx43KO小鼠骨髓、肝、脾Cx43 mRNA的表达均较杂合型小鼠下降(P<0.05).结论 PCR方法可准确鉴定子鼠的基因型.雌性Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+小鼠与雄性Cx43loxP/loxP小鼠交配是获得Cx43KO小鼠的有效途径.
