首页 > 文献资料
-
转录组测序技术在癫痫中的应用
转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术作为一种新兴的测序方法,利用高通量测序平台,对特定状态下的细胞内全部RNA进行测序分析,揭示不同物种的基因表达情况以及转录调控的规律.癫痫发病原因复杂,即使具有相同突变基因的癫痫患者,临床表现严重程度不同,提示存在额外的影响因素,RNA-seq技术通过对差异表达基因的分析,在癫痫病因的研究中发挥重要的作用.文章主要介绍RNA-seq技术与其他测序技术的比较以及不同的RNA-seq技术平台特点,并叙述RNA-seq技术在癫痫中的应用.
-
基于RNA-seq数据的生姜NAC转录因子家族鉴定及分析
NAC家族是植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、信号传导和逆境应答等过程.该研究基于生姜RNA-seq数据,利用生物信息学方法对生姜NAC家族成员、亚族分类、理化性质、蛋白质结构和表达模式进行预测和分析,结果显示:在271.1Mb生姜转录组数据中筛选得到72个生姜NAC转录因子,通过进化树分析将其分为13个亚族;不同亚族NAC蛋白质的理化性质,如氨基酸数目、等电点等存在差异,二级结构主要以无规则卷曲为主要构成元件,三级结构相似性较高;23个NAC转录因子在不同土壤湿度及青枯菌Ralstonia solanacearum侵染处理下呈现显著的表达差异,其主要分布在与植物衰老、激素代谢和细胞壁代谢相关的第Ⅻ,ⅩⅤ,Ⅷ亚族.该研究结果为生姜NAC基因家族的研究和利用提供了理论依据.
-
SNP位点rs6858698对慢性淋巴细胞白血病易感性的影响
目的 探讨rs6858698位点的功能活性及其对慢性淋巴细胞白血病易感性的影响.方法 双荧光素酶报告基因系统检测含有rs6858698位点的DNA片段的调控活性.利用CRISPR/Cas9系统在HEK293T细胞内构建点突变的稳定细胞株.全转录组测序分析(RNA-seq)不同基因型的细胞株之间的基因表达差异情况.并用实时定量PCR(RT-qPCR)和CRISPR干扰实验(CRISPRi)对RNA-seq的结果进行验证.结果 rs6858698-C DNA片段的调控活性约是rs6858698-G DNA片段的调控活性的1.69倍.转录组测序分析在两种基因型的细胞中共鉴定出140个差异表达的基因(P<0.05),其中有87个基因表达下调,53个基因表达上调.差异表达基因主要富集在9个生物学过程.RT-qPCR和CRISPRi实验的验证结果与RNA-seq的结果一致.结论 SNP位点rs6858698具有调控功能,可以通过影响与表观修饰相关的基因的表达,进而影响个体对慢性淋巴细胞白血病的易感性.
-
RNA-Seq筛选脊髓损伤后的差异基因及部分基因功能分析
目的 应用RNA-Seq技术分析脊髓损伤后不同阶段基因表达差异情况.方法 使用IH脊髓打击仪制备脊髓损伤模型,SD大鼠48只随机分成两组,假手术组和实验组,实验组分别于损伤后1d、4d和7d取材.运用RNA-Seq技术筛选脊髓损伤后不同时间点的差异表达基因,对差异基因进行表达模式分析,功能注释,通路分析等,筛选出血红素氧化酶1(Hmox1)等感兴趣基因进行mRNA和蛋白水平的验证及功能分析.结果 RNA-Seq结果表明,与假手术组相比,脊髓损伤后1d、4d和7d发生显著变化的基因分别有944、1362和1421个.上述差异基因在损伤后不同时间点的变化趋势大致可分为8种形式.Real-time PCR结果显示,Hmox1、尿激酶型纤溶酶原激活剂(Plau)、纤溶酶原激活物抑制剂(Serpine1)和中性粒细胞胞质因子(Ncf2)的表达变化与RNA-Seq测序结果基本一致.Western blotting结果显示,脊髓损伤后Hmox1的蛋白表达变化趋势与核酸水平一致;免疫组织化学结果显示,损伤之后Hmox1主要表达于脊髓组织的神经元中.结论 RNA-Seq技术能高效分析脊髓损伤后的差异基因,从大量差异基因中筛选出感兴趣基因的验证和功能分析为阐述脊髓损伤的分子机制提供了部分资料.
-
基于RNA-Seq技术分析氟康唑与环孢菌素A联合应用对生物膜态白念珠菌转录谱的影响
目的 利用转录组测序技术(RNA-Seq技术)分析生物膜态白念珠菌不同处理组间转录谱的表达差异,寻找与白念珠菌生物膜形成、耐药等相关的功能基因.方法 构建白念珠菌标准菌株的生物膜模型,将其分为生物膜态无处理组与氟康唑、环孢菌素A联合用药两个处理组,利用高通量RNA-Seq技术分析联合用药对转录组产生的影响,分析差异表达基因与生物膜形成、耐药等的相互关系,并对临床筛选的白念珠菌进行目的基因验证.结果 通过产膜能力与药物敏感性试验筛选出8株与白念珠菌标准菌株产膜与药敏结果相同的临床分离菌株.测序分析显示差异表达基因共有522个,其中上调的差异基因有253个,下调的差异基因有269个.根据GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及细胞壁、浆膜的合成,外排转运,免疫反应,菌相转换等功能;KEGG分析表明这些差异表达基因参与糖酵解,脂肪酸代谢,细胞因子受体相互作用,细胞分裂等信号通路.通过分析筛选出9个目的基因,利用临床分离株白念珠菌对目的基因验证,这些目的基因变化均与转录组结果一致.其中,als3,cdr1,cln1,cln2,rfg1,erg3,ddc1基因表达量呈不同程度的升高或降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);cpp1,efg1呈升高与降低,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用RNA-Seq技术初步分析得到与白念珠菌生物膜形成与耐药相关的几个基因,发现氟康唑与环孢菌素A联合用药抑制生物膜是一个多基因参与、多个生物过程协同调控的过程,从而为研发新型抗真菌药物提供了新的靶点,为临床合理使用抗生素药提供了依据.
-
一种针对RNA-Seq数据的基因异构体表达水平计算方法
RNA-Seq是基于高通量测序技术对转录组进行研究的实验技术,被大量用来进行基因的选择性剪切研究.针对RNA-Seq数据中读段对基因异构体的多源映射以及读段在基因参考序列上呈非均匀分布的问题,基于文本数据分析领域流的LDA(latent dirichlet allocation)模型,提出了一个新的基因异构体表达值计算方法LDAseq.利用已知的基因异构体注释信息对模型参数进行约束,解决读段对基因异构体的多源映射问题;通过引入固定长度的“探针”将基因参考序列进行分段,解决读段在整个基因参考序列上呈非均匀分布的问题.将LDAseq应用到一个小鼠数据集和一个人类乳腺癌数据集,并和目前流行的方法Cufflinks和RSEM进行对比.结果表明,所提出的LDAseq方法相比Cufflinks和RSEM准确率分别提高了75.5％和62.8％,从而获得了较为准确的基因异构体表达水平计算结果.
-
多实验平台下基因及异构体表达分析综述
转录组学研究近几年成为生命科学和医学领域的研究热点,基因表达水平测量则是转录组学研究的基础.差异基因表达分析对于了解基因功能具有重要作用,而差异异构体表达分析则能够反映选择性剪切变化的情况.当前大规模测量基因表达水平的实验平台主要包括基因芯片,以及基于高通量测序技术的RNA-Seq.首先介绍广泛使用的Affymetrix传统3'基因芯片、外显子芯片、较新的全转录组芯片,以及基于RNA-Seq技术的Illumina平台4个主流实验平台的技术原理;其次从基因表达水平计算和差异表达分析两方面介绍每个平台下一些主流数据分析方法和该研究设计的方法,分析每个平台下各数据分析方法的优劣,并进一步展示在标准数据集上一些代表性方法的对比结果.
-
RNA-Seq技术及其在胃肠肿瘤研究中的应用现状
转录组是特定的细胞或组织在特定的时间或状态下转录出来的RNA集合,转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,并能很好的显示处于表达状态的基因数量和活跃程度.作为转录组学新一代高通量测序技术之一,RNA-Seq技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息,在生物医学研究中已经得到广泛应用.随着全球胃肠肿瘤发病率的逐年提高,RNA-Seq技术在胃肠肿瘤研究领域进行全转录组测序分析的应用越来越多,并取得了一些新的进展.本文将就RNA-Seq技术原理、优势及其在胃肠肿瘤研究中的具体应用进行论述.
-
基于RNA-Seq对心肌肌钙蛋白I R193H突变限制性心肌病小鼠转录组的分析
目的 利用RNA-Seq检测正常小鼠与心肌肌钙蛋白I(cTnI)R193H突变所致限制性心肌病(RCM)小鼠中差异表达的基因,探索RCM的发病机制.方法 取3月龄C57小鼠和cTnI 193H突变小鼠的心脏,提取心肌组织全mRNA,并反转录成cDNA,PCR扩增后构建文库,进行高通量测序.分析测序结果 ,获得差异表达的基因,利用生物信息学方法分析其可能参与的生物学过程.结果共鉴定出52个差异表达基因,其中高表达基因28个,低表达基因24个(P<0.05),共涉及到16条相关KEGG通路,主要参与免疫和代谢相关的生物学过程.结论 cTnI突变可引起基因差异表达,免疫应答、线粒体能量代谢、心肌细胞分化等过程可能参与了RCM的发生发展过程.
-
RIP-Seq技术寻找与DNA-PKcs蛋白结合的RNA
目的 利用RNA免疫沉淀技术和深度测序方法寻找人骨肉瘤细胞U2OS中与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)蛋白结合的RNA,进一步研究特定RNA的功能.方法 提取对照组及8 Gy剂量照射组的U2OS细胞核蛋白,选择DNA-PKcs蛋白进行免疫沉淀,将复合体中RNA分离纯化并进行鉴定,行高通量测序分析.通过生物信息学分析得到与DNA-PKcs蛋白结合的所有RNA种类和染色体分布,KEGG和GO分析得到RNA的功能分类.后选取特定RNA分子,利用qRT-PCR方法分别对U2OS细胞总RNA及RIP提取的RNA进行表达验证.结果 U2OS细胞经8 Gy照射后DNA-PKcs蛋白结合的RNA与对照组相比,与细胞黏附相关的基因:整合素α3(integrinα3,ITGA3)、α5(ITGA5)和αV(ITGAV),以及白细胞分化抗原分化簇44(cluster of differentiation44,CD44)和多配体聚糖4(syndecan 4,SDC4)均有更强的富集.结论 成功获得了与U2OS细胞DNA-PKcs蛋白结合的RNA高通量测序库;通过测序寻找到了DNA-PKcs蛋白结合的特定RNA分子,为下一步研究其功能奠定了基础.
-
RNA-Seq与道地药材研究
RNA-Seq是一种新崛起的转录组学研究方法,利用新一代测序技术能够更为准确、快速地为人们提供更多的生物体转录信息,已广泛应用于多种生物领域.道地药材以质优、疗效好的优势历来被各医家所推崇,其道地性形成的根本是其基因型在特定时空表达的产物.因此通过转录组测序来解析其生物合成机制,已成为当前药用植物次生代谢研究的热点.本文主要介绍了RNA-Seq技术及其优势,并就其在道地药材形成机制研究方面的应用进行了讨论,为今后该技术的研究与应用提供参考.
-
内生菌Phialocephala fortinii影响大花红景天代谢的差异途径及基因表达
药用植物发育和代谢受到多种因素的影响,而内生真菌对植物的影响是近年来才得以重视并逐步成为热点.为探索内生真菌Phialocephala fortinii对大花红景天基因及代谢途径的影响,本实验通过RNA转录组测序筛选差异表达基因;并用Real-time PCR对基因表达进行验证,利用2-△△Ct的方法分析脂代谢、信号转导和环境适应性等重要代谢途径差异基因的相对表达量.结果表明,验证结果与测序结果一致,内生真菌P.fortinii能够促进大花红景天脂代谢途径中的差异基因表达量;它对信号转导途径中相关基因表达的影响不同,但控制Notch信号通路途径的基因表达量显著提高,为对照组的34倍;对适应性代谢途径差异基因表达上调,进而促进红景天环境适应能力.研究结果旨在为揭示内生真菌与红景天的互作机制、红景天道地性形成原因、内生真菌功能的开发等提供分子基础数据.
-
转录组在肿瘤中的应用及进展
转录组(RNA-Seq)是新一代测序技术,利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序,从整体水平研究基因的功能及其结构,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机制,而癌症疗效评估的关键在于肿瘤的复发率和对放化疗的敏感性.新一代测序系统有望识别导致肿瘤的形成和对治疗产生抵抗的相关靶基因,对进一步指导临床治疗和诊断具有重要的理论及实践意义.
-
Fkbp51基因敲除小鼠肝脏与大脑海马区RNA表达谱系的分析比较
目的 通过分析野生型小鼠(WT)与Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝脏、海马RNA表达谱系之间的差异,研究Fkbp51基因在代谢通路和神经通路中的作用.方法 利用第二代测序技术对Fkbp51KO与WT小鼠的肝脏与海马mRNA进行表达谱测序,将测序结果用BRB-ArrayTools进行分析,筛选出小鼠肝脏与海马的差异基因,然后分别利用在线工具DAVID对差异基因进行GO本体分析,STRING数据库对其进行蛋白质的相互作用网络分析,并利用Genecard对基因进行注释.结果 (1)Fkbp51的缺失,在肝脏中造成类固醇生物合成及代谢、脂类物质代谢以及氧化还原反应等相关基因表达水平的变化;(2)在海马中造成机械刺激探测、学习或记忆、突触传递的调节、PPAR信号通路、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等相关基因表达水平的变化;(3)在肝脏与海马中,Fkbp51的缺失同时造成了11个基因的共差异表达,这11个基因的蛋白网络互作图显示:HMGCS2与INSIG1及相关蛋白形成网络,而USP2与PER、CRY、DBP等相关蛋白形成另一个网络.这两个网络既参与代谢也参与神经调节.结论 Fkbp51在代谢与神经中的作用既是相互独立又是相互联系的.
关键词： Fkbp51基因敲除小鼠 肝脏 神经系统 RNA-seq -
Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响
目的 通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响.方法 利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用TopHat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE).通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能 (gene ontology, GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI 基因数据库对这些基因进行注释.结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关.(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关.结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能.
-
黄芩水煎剂对尿道致病性大肠埃希菌的转录组影响分析
目的 探讨黄芩水煎剂抑制尿道致病性大肠埃希菌的分子机制.方法 采用RNA-seq技术分析黄芩水煎剂对尿道致病性大肠埃希菌临床分离株(NB8)转录组的影响.设黄芩组和阴性对照组2个组,黄芩组用10倍MIC浓度的黄芩水煎剂(62.5 mg/mL)作用于尿道致病性大肠埃希菌NB8株30 min,对照组给等量生理盐水,提取细菌总RNA,去除rRNA,反转录合成cDNA,在HiSeq2000测序平台上进行转录组测序,利用BIGpre、Tophat、Cuffiinks等生物信息学工具软件进行转录组数据处理;并将得到的表达谱作差异表达、GO和COG功能富集以及KEGG代谢通路分析.结果 黄芩组和对照组之间差异表达基因共有1 665个,其中上调基因为1 169个,下调基因为496个;在黄芩水煎剂的作用下,尿道致病性大肠埃希菌NB8株糖酵解、三羧酸循环和脂肪酸生物合成等关键代谢途径的编码基因以及核糖体蛋白的编码基因显著下调,而细菌趋化性和鞭毛组装途径以及ABC转运蛋白通路相关基因表达显著上调.结论 阐明了黄芩水煎剂抑制尿道致病性大肠埃希菌的分子机制,黄芩作用的靶位是糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸的生物合成途径和蛋白质的翻译;此外,细菌趋化性、鞭毛组装途径和ABC转运蛋白在细菌对黄芩的应激反应中也具有重要作用.
-
基于RNA-seq的银线草转录组分析
目的 获得银线草Chloranthus japonicus根茎转录组信息特征.方法 用高通量测序平台Illumina HiSeqTM 2000150PE进行银线草根茎转录组测序分析.结果 转录组测序共获得68 458 750条高质量序列(clean reads),Trinity de novo组装获得56 096个unigenes,平均长度801 nt.BLAST分析显示分别有25 773 (45.94％)、17 801 (31.73％)、16 082 (28.67％)、9 649 (17.20％)个unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类40分支,涉及131个KEGG标准代谢通路,其中包括16个次生代谢标准通路.进一步分析获得170个基因参与单萜、二萜、倍半萜、三萜等萜类化合物生物合成通路.同时,转录组预测编码蛋白框序列1 887个;高等植物转录因子54个家族.借助MISA软件发现8 987个简单重复序列(SSRs),二碱基重复SSRs数量丰富,有5 948个,出现频率为66.2％,五碱基重复SSRs相对较少,占1.3％.结论 基于RNA-seq分析获得银线草根茎转录组信息特征及萜类合成代谢通路关键基因,为后期银线草活性成分次生代谢途径解析及调控研究奠定基础.
-
基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征
背景:腰突颗粒是课题组治疗腰椎间盘退行性疾病的经验方,一直有较好的临床疗效,但其作用机制一直未明确.目的:基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨临床经验方腰突颗粒防治腰椎间盘退变的可能分子机制.方法:将10只新西兰大白兔按随机数字表随机分为生理盐水组和腰突颗粒组(n=5),生理盐水组予以生理盐水20 mL/次灌胃,腰突颗粒组予以灌服腰突颗粒水煎剂20 mL/次,均2次/d,连续灌胃1周.于后一次灌胃完成2 h后经颈总动脉采血收集兔血清分别制作为10%DMEM培养液;分别使用2种血清培养液培养人髓核细胞,镜下观察2组细胞形态,锥虫蓝染色后测定2组细胞活力;另取第3代髓核细胞,干预48 h后采用RNA-Seq技术对2组细胞中的mRNA进行检测,进行转录组测序筛选差异mRNA;将得到测序结果进行差异基因表达、GO功能显著性富集及Pathway显著性富集分析.结果与结论:①腰突颗粒组髓核细胞贴壁后以圆形或梭形多见,胞浆充足,胞核清晰.细胞核核表面光滑,核膜完整,长条状粗面内质网排列整齐,线粒体少,胞质内可见散在溶酶体及纤丝;生理盐水组细胞呈梭形和多角形,细胞核大,核仁多为2或3个,细胞核表面稍粗糙且质网可见轻微扩张,线粒体少且有部分膜不完整;②腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均优于生理盐水组(P<0.05);③比较2组测序结果发现,差异表达基因共有464个,其中上调基因有143个,下调基因有321个.差异基因的GO功能显著性富集分析显示,差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程中.差异基因的Pathway显著性富集分析结果发现,主要集中在代谢相关通路;④综上,通过RNA-Seq技术获得了腰突颗粒防治椎间盘退变作用的差异基因表达谱,腰突颗粒防治椎间盘退变的分子机制主要通过调节上调细胞外基质代谢相关基因及下调多糖合成相关基因实现,可为进一步研究提供基础.
-
传统药用植物转录组研究进展
转录组测序技术(RNA-seq)是一种新兴的转录组学研究方法,是现今药用植物基因组研究中活跃的领域之一.能够研究不同时期,不同组织类型、不同环境条件以及不同生理状态等各个不同条件下的基因表达差异及调控模式差异,快速、准确地提供药用植物的转录本信息,获得有效的基因编码序列.参考近年来药用植物转录组研究文献,简要介绍了转录组测序技术方法及其在药用植物中的研究现状,并从药用植物自身发育机制、次生代谢产物生物合成途径和SSR分子标记开发等3个方面综述了国内外近年来转录组测序在药用植物上的应用进展.
-
克氏综合征基因表达谱分析
目的 对克氏综合征(Klinefelter syndrome)患者进行基因表达谱分析,探讨其基因差异表达与临床表型之间的关系.方法 采用第二代高通量测序方法对7例克氏综合征患者和7例对照男性外周血全基因组mRNA进行深度测序,运用定量RT-PCR方法对30例克氏综合征患者及30例对照男性进行验证.结果 测序结果根据FDR≤0.001和| log2 Ratio≥1 |的标准,两组比较存在差异表达基因216个,差异具有统计学意义.其中X染色体基因9个,占4％,与X染色体失活相关的XIST差异表达明显;常染色体基因207个,占96％,其中NR4A3、ZKSCAN4、HBEGF、EREG、AREG、NR4A2、CCR5差异表达明显.NR4A3主要.与2型糖尿病有关,HBEGF主要参与促性腺激素分泌过程.Y染色体不存在显著差异表达基因.结论 克氏综合征患者不仅多余X染色体基因差异表达,还有大量常染色体基因差异表达,这可能是克氏综合征临床表型多样化的原因.
