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人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化
目的克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCm-T,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-22b(+)相应位点,转化E. coli BL21,IPTG诱导蛋白表达.超声破碎菌体,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1.8g/L; RT-PCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCm-T/canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET-22b(+)/canstatin,BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18.2%、18.8%、23.0%和23.4%;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.
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人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达
目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b(+),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b(+),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.
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pcDNA3.1-Canstatin-3Flag真核表达载体的构建及转染HepG2细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1-Canstatin-3Flag载体并稳定转染肝癌HepG2细胞,检测canstatin在mRNA水平的表达.方法:胎盘中提取总RNA,RT-PCR法获得canstatinDNA,克隆至pcDNA3.1(-)载体中,并测序,重组质粒pcDNA3.1-Canstatin-3Flag转染肝癌HepG2细胞,G418筛选出稳定转染细胞,RT-PCR检测canstatin mRNA表达.结果:1.成功构建出pcDNA3.1-Canstatin-3Flag重组质粒;2.获得稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepC2细胞;3.发现转染后的肝癌HepG2细胞canstatin在mRNA水平比未转染细胞有明显的增强.结论:获得了稳定转粢pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepG2细胞,为后期canstatin在肝癌中的研究提供了支持.
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重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定
目的:克隆并表达canstatin基因,初步检测其抑制血管生成的活性.方法:采用RT-PCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA,克隆人pMD18-T载体中,并测序鉴定.在QIA表达系统中表达,Ni柱亲和层析纯化.进行生物学活性鉴定.结果:经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致,重组进pQE30表达载体,IPTG诱导表达并纯化成功,表达产物能明显抑制血管生成.结论:成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达.纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)实验中具有明显抑制血管生成活性.
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人canstatin基因的克隆及序列分析
目的克隆人的canstatin基因并进行序列分析.方法从人引产死胎肝组织提取总RNA,以此为模板应用RT-PCR法克隆canstatin该基因片段.结果所得基因片段DNA序列分析由684个碱基组成.结论克隆的canstatin序列与文献报道完全一致.
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血管生成抑制因子canstatin与肿瘤的关系
Canstatin为Ⅳ型胶原α2链双链片段的内源性蛋白, 作为特异性的血管生成抑制因子,能抑制内皮细胞(EC)增生、迁移并有抑制EC形成血管等功能,有望成为抑制肿瘤生长的新途径.作者对canstatin的发现、生物学特性及其与肿瘤的关系进行了综述.
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人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化
目的:构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E coli DH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定.其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致.将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b(+),转化E.coli BL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%.将诱导3 h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论:成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.
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血管生成抑制剂Canstatin联合豆蔻提取物治疗荷瘤裸鼠实验研究
目的:探讨canstatin联合豆蔻提取物对人胃癌细胞株SGC-7901胃癌模型裸鼠肿瘤生长的影响.方法:建立裸鼠原位移植人胃癌模型,将模型裸鼠随机分为Canstatin组、豆蔻提取物组、联合用药组,同时设立对照组,对原位种植胃癌的体积和抑瘤率、肿瘤微血管密度进行观察,行凋亡指数检测.结果:豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组的抑瘤率分别为28.8%、38.9%、44.1%;豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组、对照组的肿瘤微血管密度(MVD)分别为23.81±8.15、21.50±9.17、19.01±7.15、29.45±6.72.结论:豆蔻提取物与Canstatin均可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长,促进移植瘤细胞的凋亡,降低肿瘤微血管密度,但以联合作用效果显著.
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人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建
[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin.[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatin cDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatin cDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析.[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致.[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础.
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癌抑素Canstatin的抗肿瘤作用及其机制
Canstatin是一种来源于Ⅳ型胶原α2链非胶原(NC1)区的血管生成和肿瘤生长抑制因子.它能剂量依赖性抑制血管内皮细胞增殖和迁移,诱导内皮细胞凋亡,在体内实验中Canstatin显著抑制实体瘤的生长.Canstatin的抗肿瘤作用可能与诱导凋亡有关,其作用机制在于抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt(PI3-k/Akt)信号通路,并依赖膜死亡受体介导的信号事件.
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人canstatin腺病毒载体的构建及在卵巢癌细胞的表达
目的:构建并鉴定人canstatin基因腺病毒表达载体Ad-can及研究在卵巢癌的表达.方法:(1)提取人卵巢癌组织总RNA,设计带有特殊酶切位点的引物,用RT-PCR方法扩增canstatin片段,克隆入载体pMD-18T,并转化至大肠杆菌DH5α,大量扩增目的基因(pMD-can);(2)双酶切pMD-can和pAdtrack质粒,酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接,获得pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)穿梭载体;(3)Pme I酶切pAdtr-can,使其线性化,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy共同转化大肠杆菌BJ5183,使其同源重组,获得pADeasy-canstatin(pAd-can)载体;(4)内切酶Pac I再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293,借助GFP表达观察包装病毒Ad-can.重组腺病毒载体感染HEK293细胞扩增病毒,经4次扩增、纯化后,用空斑形成实验法测病毒滴度;(5)用包装的病毒转染卵巢癌细胞H08910PM,借助GFP的荧光表达观察卵巢癌细胞转染情况;(6)RT-PCR检测转染后卵巢癌细胞中目的基因的表达.结果:各中间载体经酶切鉴定,DNA测序证实正确.转染的HEK293细胞2～3天产生病毒,7～10天出现病毒斑.终包装的病毒中携带有目的基因canstatin,并能够在包装细胞中表达.用空斑形成实验法测定病毒滴度约为1.6×1011 pfu/ml.将包装的病毒转染卵巢癌细胞,荧光显微镜下可观察到大部分卵巢癌细胞发出绿色荧光,经RT-PCR检测可发现canstatin基因扩增片段.结论:大肠杆菌内同源重组法能有效和较方便的构建canstatin基因腺病毒载体Ad-can.重组子Ad-can能转染卵巢癌细胞,并在卵巢癌细胞中表达,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢肿瘤提供了良好的转导载体.
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结肠癌组织中canstatin基因的表达
目的 观察canstatin基因在结肠癌组织中的表达及意义.方法 采用RT-PCR检测40例结肠癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中canstatin mRNA的表达情况.PCR产物经凝胶电泳,比较各组织中canstatin与GAPDH条带的灰度值之比.半定量分析canstatin mRNA的表达水平.结果 癌组织中canstatin mRNA表达水平(0.47±0.14)低于癌旁组织(0.58±0.18)和远癌组织(0.62±0.21);随着肿瘤分化程度的升高,canstatin mRNA在癌组织中的表达也增加(P<0.05),但canstatin mRNA表达与结肠癌临床分期(TNM)、淋巴结转移和病理类型均无统计学差异(P>0.05).结论 canstatin mRNA在结肠癌组织中低表达,说明can-statin基因在结肠癌的发生发展中可能发挥重要作用.
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含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建
目的：构建含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。方法：采用RTP-CR 的方法，获得含有人canstatin 的cDNA片段以及分别在5’UTR下游和3’UTR上游添加了翻译增强序列（ UUAACUUUA）的人canstatin cDNA 片段，将得到的目的片段分别连接到PMD18-T载体上，利用该载体将目的片段连接到荧光素酶基因Lux Ct表达盒中并进行酶切鉴定。结果：RT-PCR分别得到约700 bp的cDNA片段并克隆到PMD18-T载体上。用PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切 Lux Ct质粒，得到2100 bp和10000 bp 的2条片段。然后，将大片段回收后分别与上一步得到的cDNA片段进行连接，酶切鉴定结果显示含有翻译增强序列的人canstatin 片段成功插入到Lux Ct质粒中。结论：成功构建了含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。
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结肠癌组织中canstatin mRNA的表达
目的:检测canstatin mRNA在结肠癌组织中的表达情况.方法:采用RT-PCR检测结肠癌、相应癌旁和远癌组织各40例中canstatin mRNA的表达情况.结果:癌组织中canstatin mRNA相对表达量为(0.47±0.14),低于癌旁组织的(0.58±0.18)和远癌组织的(0.62±0.21)(F=4.075,P=0.03);canstatin mRNA在低分化癌组织中的相对表达量为(0.44±0.20),低于中分化组织的(0.59±0.25)和高分化组织的(0.63±0.09)(F＝3.121,P=0.04),canstatin mRNA表达与结肠癌Dukes分期、淋巴结有无转移、患者性别及年龄均无关(F或t分别为1.012、1.961、1.661和2.011,P均>0.05).结论:canstatin mBNA在结肠癌组织中低表达,町能在结肠癌的发生发展中发挥重要作用.
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canstatin基因治疗对小鼠人卵巢癌移植瘤生长及Caspase-3、Flk-1蛋白表达的影响
目的:探讨canstatin基因治疗对人卵巢癌移植瘤的影响.方法:18只裸鼠皮下接种人卵巢癌H08910PM细胞制备人卵巢癌移植瘤模型,当移植瘤体积达到50 mm3时,随机分3组治疗,分别注射腺病毒介导的canstatin基因(Ad-can)、Ad-GFP和PBS,2次瘤内多点注射,间隔72 h,每次4 × 1010 pfu.治疗期间每周2次用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径和短径并计算移植瘤体积;治疗30 d后处死裸鼠,切取肿瘤检测肿瘤组织中Caspase-3、Flk-1蛋白的表达.结果:Ad-can治疗组肿瘤体积小于其余2组(P<0.05).3组肿瘤组织中均有坏死,Ad-can治疗组坏死明显.Ad-can治疗组Caspase-3蛋白表达高于Ad-GFP组和PBS组(P<0.05).Flk-1蛋白的表达低于其他2组(P<0.05).结论:人canstatin基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的血管生成,从而抑制人卵巢癌细胞的生长.
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人canstatin基因转化盐藻反应器真核表达载体的构建
目的:构建人canstatin基因转化盐藻反应器的真核表达载体.方法:采用RT-PCR扩增得到人canstatin cDNA,克隆到pMD18-T载体形成pMD18-T/Can重组质粒.对pMD18-T/Can进行酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的canstatin基因定向连接到真核表达载体pUΩ上,然后连接上筛选标记bar盒,构建了含有人canstatin基因的真核表达载体pUΩ-Can-Bar.结果与结论:鉴定结果显示,转化盐藻反应器的真核表达载体pUΩ-Can-Bar构建成功.
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人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达
目的:构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中表达canstatin重组蛋白.方法:用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增canstatin的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析.将canstatin cDNA定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,而后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达.结果:canstatin cDNA克隆入质粒pET30a(+)获得了重组表达载体pET30a(+)/Cans,canstatin的cDNA长度为684 bp,编码227个氨基酸.IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/Cans在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体总蛋白量的35%.结论:原核表达载体pET30a(+)/hCans在大肠杆菌BL21中高效表达canstatin重组蛋白.
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两种源于胶原Ⅳ非胶原区具有抑制血管形成和肿瘤生长的功能肽
Tumstatin和Canstatin是继Restin、angiostatin和endostatin之后新发现的基底膜来源人胶原Ⅳ肿瘤血管生成抑制因子.Tumstatin来源于胶原Ⅳα3链,其N-端54～132氨基酸功能肽能够抑制内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡,N-端197～215氨基酸[α3(Ⅳ) NC1 185～203 氨基酸]功能肽能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖.Canstatin是来源于Ⅳ型胶原α2链的24 kD的血管生成和肿瘤生长抑制因子,它能剂量依赖性抑制内皮细胞管状结构的形成,有效抑制内皮细胞的增殖和迁移,并能诱导内皮细胞凋亡.在小鼠移植瘤模型体内实验中,Tumstatin和Canstatin都显示出对实体瘤生长的显著抑制作用.
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canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义
目的 探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响.方法 将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆.用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性.结果 检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P＜0.01),转染细胞生长明显受抑.结论 canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡.
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血管形成抑制剂Canstatin在鼻咽癌中表达鉴定及基因克隆
目的 检测Canstatin基因在鼻咽癌发病过程中的表达变化及克隆其编码序列.方法 利用半定量RT-PCR方法检测Canstatin在鼻咽癌组织、鼻咽癌细胞和正常鼻咽组织中的表达,比较它们之间的表达差异.设计含酶切位点的PCR引物,利用RT-PCR方法从相对正常鼻咽组织中获取Can-statin蛋白编码序列,T/A克隆入Pmd18载体中.利用PCR和酶切鉴定获得阳性重组子.重组子后经测序证实.结果 与相对正常鼻咽组织相比,Canstatin在鼻咽癌组织和细胞中表达下调或缺失.RT-PCR法成功获得Canstatin基因编码区全长Cdna序列.重组克隆质粒插入片段经DNA测序后与Gen-Bank中Canstatin基因相应序列比较,100%同源.结论 Canstatin在鼻咽癌组织和细胞中表达下调或缺失.采用T/A技术成功克隆鼻咽组织中Canstatin基因,为Canstatin亚克隆入真核表达载体Pegfp-N1,探索其在鼻咽癌生长和转移中的作用奠定了基础.
