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SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用
目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.
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SHIP基因突变对白血病细胞系K562细胞迁移及侵袭的影响
目的 研究含SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP)基因碳末端PxxP结构域点突变对细胞体外迁移及侵袭能力的影响及其机制.方法 采用基因转染技术将携带野生型(wt)和突变型(mu)SHIP基因的慢病毒载体感染人白血病细胞系K562细胞；采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测转染后各组SHIP基因表达水平；采用Transwell小室比较K562/wtSHIP、K562/muSHIP转染后K562细胞跨膜及侵袭能力有无差别；Westem blot法比较各组细胞基质金属蛋白酶( MMP)-2、MMP-9和磷酸化灶性黏着斑激酶(p-FAK)的表达情况,并检测各组细胞NF-KB活性改变.结果 感染慢病毒48 h后FQ-PCR和Westemblot法检测结果显示SHIP基因在K562细胞中表达明显升高；K562/wtSHIP组细胞迁移指数为(15.8±1.4)％,明显低于K562/muSHIP组[(54.3±2.4)％]和转染空载体的细胞对照组[K562/猫免疫缺陷病(pFIV)组,(50.3±3.8)％](P＜0.01)；K562/muSHIP组与K562/pFIV组差异无统计学意义(P＞0.05)；侵袭实验显示K562/wtSHIP组迁移到碳酸脂膜的细胞[(32±6)/视野]较K562/pFIV细胞[(78±13)/视野]和K562/muSHIP细胞[(83±16)/视野]明显减低.而K562/pFIV细胞与K562/muSHIP细胞比较,在侵袭能力上差异无统计学意义(P＞0.05).K562/muSHIP细胞p-FAK和NF-KB表达明显高于K562/wtSHIP细胞.结论 SHIP基因碳末端PxxP结构域对于SHIP基因负调节功能有重要作用.此位点发生突变通过影响FAK蛋白磷酸化、NF-KB活化以及MMP-9的表达影响K562细胞的体外迁移和侵袭能力；SH IP基因碳末端PxxP结构域点突变可能为致病性突变,可能是白血病细胞中SHIP功能异常的原因之一.
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急性白血病细胞SHIP基因的突变分析
目的评价SHIP基因突变在白血病发病中的作用.方法利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、单链构象多态性(SSCP)及DNA序列分析技术检测了41例急性白血病患者、50名正常人的骨髓或外周血标本、8株白血病细胞系SHIP基因表达及突变情况.结果RT-PCR显示所有标本中都有SHIP基因表达,发现32例急性髓系白血病(AML)患者中有7例(22%)和9例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中有1例(12%)存在SHIP基因的突变,其中1例AML患者发病时标本同时存在2个错义突变,而完全缓解后消失.发病时患者的白血病细胞在体外随着IL-3的刺激其Akt磷酸化明显增加.结论首次发现急性白血病细胞中SHIP基因突变,提示SHIP基因的突变可能与白血病发病有关,在造血细胞中,很可能作为一个抑癌基因通过负性调节PI3K/Akt信号通路发挥作用.
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SHIP在口腔鳞癌中表达研究
目的：探讨含SH2结构域的肌醇磷酸酶（SHIP）在口腔鳞癌中的表达。方法选择中国医科大学附属口腔医院口腔颌面外科2008-2011年间收治的36例口腔鳞癌患者，术后应用免疫组化方法对其癌旁正常组织、原发灶及转移淋巴结中SHIP、基质金属蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达情况进行检测。结果癌旁正常组织中SHIP呈中高强度阳性表达，明显高于原发灶及转移淋巴结（P<0.05）；而原发灶及转移淋巴结中MMP-2和MMP-9表达强度显著高于癌旁正常组织（P<0.01）。结论 SHIP基因可能通过负反馈作用来调节肿瘤的侵袭和转移。
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抗小鼠SHP-1、SHP-2和SHIP三种蛋白酪氨酸磷酸酶单克隆抗体的制备及鉴定
为了制备抗小鼠蛋白酪氨酸磷酸酶的单克隆抗体(mAb),分别以SHP-1、SHP-2和SHIP重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb.用Western blot检测mAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性.共获得12株可稳定分泌抗磷酸酶mAb的杂交瘤细胞株.其中6株可分泌抗SHP-1 mAb(LX-SHP1.1～LX-SHP1.6),3株可分泌抗SHP-2 mAb(LX-SHP2.1～LX-SHP2.3),3株分泌抗SHIP mAb(LX-SHIP1～LX-SHIP3).LX-SHP1.2～LX-SHP1.6,LX-SHP2.1和LX-SHP2.3,以及LX-SHIP2和LX-SHIP3可应用于相应重组蛋白的Westernblot检测.LX-SHP1.5,LX-SHP2.3,以及LX-SHIP2在EL-4细胞及原代T细胞相应天然磷酸酶分子的Western blot检测中有较好的实验效果.
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SHIP及其相关信号通路与炎症性肠病
人类SHIP蛋白为肌醇磷酸酶家族成员之一,由定位于染色体2q37.1的INPP5D基因编码,主要表达于造血细胞中,在造血细胞的生长、分化和功能发挥方面起关键性负向调控作用.PI3K信号通路对免疫系统功能的调控具有重要意义.SHIP能特异性地水解PI3K的第二信使PI-3,4,5-P3(PIP3)肌醇环上的5'位磷酸,生成PI-3,4-P2,从而下调PI3K依赖性Akt激活,负向调控PI3K-Akt信号通路.目前对SHIP在包括炎症性肠病(IBD)在内的自身免疫性和炎症性疾病中的表达及其意义仍处于探索阶段,尚未形成系统性认识.本文就SHIP及其相关信号通路与IBD的关系作一综述.
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外源性SHIP基因对K562细胞周期及其相关蛋白表达的影响
目的:探讨SHIP基因对人白血病细胞系K562细胞周期的调控作用.方法:用携带野生型SHIP基因及绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒及空载体慢病毒转染人白血病K562细胞.FCM检测转染效率、细胞凋亡率及细胞周期变化,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)检测SHIP mRNA水平的变化,Western 印迹法检测SHIP、cyclin D1、p21WAF1/CIPI、p27KIP1蛋白表达水平的变化.结果:与转染空载体组和未转染组相比,转染野生型SHIP基因的K562细胞增殖减慢,凋亡率明显上升(P＜0.05);细胞周期显示,G0/G1期延长,G1期前出现亚二倍体的凋亡峰,S期和G2/M期比例降低;cyclin D1表达降低,p21WAF1/CIPI和p27KIP1表达增加.结论:转染野生型SHIP基因可使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制白血病细胞增殖,促进白血病细胞凋亡.
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伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响及促凋亡作用
目的:观察甲磺酸伊马替尼干预K562细胞后SHIP、caspase-1、caspase-3、caspase-9及bcl-2基因表达的变化,初步探讨伊马替尼促凋亡的作用途径.方法:将不同浓度甲磺酸伊马替尼与K562细胞在体外共培养,于不同时段留取标本,采用实时定量PCR方法检测SHIP基因表达水平的变化,并用半定量逆转录PCR方法检测抗凋亡基因bcl-2及促凋亡基因caspase-1、caspase-3、caspase-9表达水平的变化,用MTT法观察伊替尼对细胞增殖的抑制作用,用膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双标记法分析细胞凋亡.结果:甲磺酸伊马替尼可使K562细胞内SHIP基因表达水平升高,且与剂量和作用时间有关;caspase-9表达水平亦升高并与SHIP基因表达水平有直线相关关系;而caspase-1、caspase-3和bcl-2表达水平无显著变化;伊马替尼可使细胞增殖率降低、凋亡率增加,并可见到明显的形态学变化.结论:甲磺酸伊马替尼可使K562细胞内SHIP及caspase-9基因表达水平升高且可促进细胞凋亡,其促凋亡作用机制可能与上调SHIP和caspase-9基因表达有关.
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SHIP基因诱导白血病细胞株K562凋亡及其机制
肌醇5′磷酸酶(src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase,SHIP)是继PTEN之后发现的又一肌醇磷酸酶,对造血细胞增殖有关键负调控作用.目前国内外对SHIP基因与人类肿瘤抑制关系方面的研究报道较少.本研究利用携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体稳定感染K562细胞,应用实时荧光PCR、Western blot检测转染前后细胞内SHIP基因mRNA和蛋白水平的变化,MTT测定细胞增殖水平的变化,ELISA检测相关激酶活性,TUNEL、Hoechst 33342检测细胞凋亡的变化,从而探讨SHIP基因诱导K562凋亡的机制,分析SHIP基因在白血病发病中的意义.结果如下:(1)K562细胞SHIP蛋白表达阴性;(2)携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体转染使K562细胞表达SHIP mRNA和蛋白;(3)与对照组相比,转染野生型SHIP基因导致K562细胞生长受抑,并出现明显的凋亡征象;(4)转染SHIP基因的K562细胞Akt磷酸化水平降低;NF-κB和bcl-xL表达降低;同时细胞促凋亡基因bad、p27表达和caspase-9、caspase-3活性明显增高.上述结果提示SHIP通过抑制P13K/Akt路径中Akt的磷酸化,促进其下游bad、p27表达和caspase-9、caspase-3的活化,抑制bcl-xL,终诱导白血病细胞凋亡;另外,NF-κB表达下调也是SHIP抑制白血病细胞增殖并促进细胞凋亡的重要作用机制.
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乳腺癌中PTEN、SHIP的表达对淋巴转移的影响
乳腺癌常见的转移方式是淋巴转移,也是影响乳腺癌治疗效果的一个重要因素.在淋巴转移的生物学过程中存在抑癌基因的缺失和变异.PTEN、SHIP的表达在乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移中可能起重要作用,其表达缺失促进了乳腺癌的淋巴转移,因此可以作为判定乳腺癌生物学行为的客观指标.本文综述PTEN、SHIP基因在乳腺癌中的表达对淋巴转移的作用.
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系统性红斑狼疮患者B细胞激活后FcγRⅡb1向脂筏信号域转移减少
目的 观察系统性红斑狼疮(SLE)患者B细胞激活后FcγRⅡb1信号分子向脂筏信号域转移的改变.方法 收集SLE患者和正常人外周血并分离出B细胞,分别用抗人μ链的F(ab’)2片段[F(ab’)2anti-μ]单独刺激B细胞抗原受体(BCR),或用抗人μ链的完整IgG(IgG anti-μ)激活B细胞、同时实现BCR与FcγRⅡb1的交联;采用密度梯度超速离心法提取B细胞膜脂筏;免疫沉淀及Western blot法分别检测膜脂筏中FcγRⅡb1的分布、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、及脂筏FcγRⅡb1对含SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP)的招募.结果 SLE患者B细胞经F(ab’)2 anti-μ单独刺激BCR后,胞膜脂筏部位FcγRⅡb1的分布、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、以及脂筏FcγRⅡb1对SHIP的招募,与正常对照组比较均无明显改变,但经IgG anti-μ激活B细胞以实现BCR与FcγRⅡb1的交联后,以上指标均显著低于正常对照组.结论 SLE患者B细胞经IgG anti-μ激活后,转移至膜脂筏部位的FcγRⅡb1、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、以及脂筏FcγRⅡb1对SHIP的招募均显著减少.
