首页 > 文献资料
-
人FcγRⅡb1基因真核载体的构建、表达及其对B细胞增殖的影响
目的 构建人FcγRⅡb1基因的真核表达载体并转染人B细胞,观察其在B细胞的表达及其对细胞增殖的影响.方法 分离健康人外周血B细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA,采用PCR技术扩增出含有EcoR Ⅰ和SalⅠ酶切位点的人FcγRⅡb1基因片段,将双酶切产物通过T4 DNA连接酶定向插入pIRES2-EGFP真核载体相应位点中,经酶切及双向测序鉴定其序列的正确性.通过电穿孔法将pIRES2-EGFP-Fc γ RⅡb1重组载体转入人B细胞中,采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率及细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平,采用3H-TdR掺入法检测转染FcγRⅡb1基因对B细胞增殖能力的影响.结果 酶切及测序鉴定pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1重组质粒基因序列完全正确,重组质粒转染细胞的效率为15.5％,转染细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平显著增高,并显著抑制了B细胞增殖能力.结论 成功构建了pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1真核表达载体,并赋予了FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用.
-
转染FcγRⅡb1基因纠正SLE患者B细胞的过度活化
目的 观察转染FcγRⅡb1基因能否纠正SLE患者B细胞的过度活化.方法 构建人FcγRⅡb1基因真核载体,通过电穿孔转染SLE患者B细胞.分别采用抗人μ链的F(ab’)2片段[F(ab’)2 anti-μ]和抗人μ链的完整IgG(IgG anti-μ)2种抗体刺激B细胞,同时以正常人B细胞作对照.采用分光光度计检测激活B细胞胞内[Ca2+]i反应,3H-TdR掺入法检测B细胞的增殖能力,ELISA法检测B细胞分泌抗体的功能.结果 分别以F(ab’)2 anti-μ和IgG anti-μ激活SLE患者B细胞后,细胞内[Ca2+]i反应、cmp值及IgG分泌量的比值均显著低于正常人(P＜0.01),通过转染FcγRⅡb1基因后,这些比值均显著提高(P＜0.01或P＜0.05).结论 转染FcγRⅡb1基因能有效纠正SLE患者B细胞过度的活化、增殖及抗体分泌.
-
系统性红斑狼疮患者B细胞激活后FcγRⅡb1向脂筏信号域转移减少
目的 观察系统性红斑狼疮(SLE)患者B细胞激活后FcγRⅡb1信号分子向脂筏信号域转移的改变.方法 收集SLE患者和正常人外周血并分离出B细胞,分别用抗人μ链的F(ab’)2片段[F(ab’)2anti-μ]单独刺激B细胞抗原受体(BCR),或用抗人μ链的完整IgG(IgG anti-μ)激活B细胞、同时实现BCR与FcγRⅡb1的交联;采用密度梯度超速离心法提取B细胞膜脂筏;免疫沉淀及Western blot法分别检测膜脂筏中FcγRⅡb1的分布、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、及脂筏FcγRⅡb1对含SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP)的招募.结果 SLE患者B细胞经F(ab’)2 anti-μ单独刺激BCR后,胞膜脂筏部位FcγRⅡb1的分布、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、以及脂筏FcγRⅡb1对SHIP的招募,与正常对照组比较均无明显改变,但经IgG anti-μ激活B细胞以实现BCR与FcγRⅡb1的交联后,以上指标均显著低于正常对照组.结论 SLE患者B细胞经IgG anti-μ激活后,转移至膜脂筏部位的FcγRⅡb1、脂筏FcγRⅡb1酪氨酸残基磷酸化水平、以及脂筏FcγRⅡb1对SHIP的招募均显著减少.
