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Tumstatin基因抗肿瘤血管生成片段Tum-5的研究进展
本文就肿瘤抑素(Tumstatin)抗血管生成活性片段Tum-5的相关研究进展做一综述.
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Tumstatin治疗喉鳞癌的实验研究
目的 探讨肿瘤抑素(Tumstatin)对喉鳞癌细胞(Hep-2)的治疗作用.方法 用Hep-2细胞株进行传代培养,台盼蓝法观察Tumstatin和顺铂对不同培养时间细胞的生长抑制情况;MTT法检测不同浓度的Tumstatin对Hep-2细胞存活率的影响,光镜观察细胞形态的变化;电镜和3′-原位末端标记法(TUNEL)检测Hep-2细胞凋亡的发生和形态学改变.结果 ①随着药物对Hep-2细胞作用时间的延长,细胞生存率明显降低,存在时间依赖性;②MTT检测显示,Tumstatin对细胞的增殖的抑制效应具有剂量依赖性;③光镜观察发现,药物作用组细胞出现病变;④电镜和TUNEL染色证实,Tumstatin对Hep-2细胞的抑制作用是以促进细胞凋亡为主.结论 Tumstatin可能通过促进细胞凋亡发挥抗肿瘤的作用.
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血管基膜衍生多功能肽基因克隆、表达及空间构象分析
目的:构建血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体,并对血管基膜衍生多功能肽氨基酸序列进行空间结构分析预测.方法:用人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的2个功能区片段,即血管基膜衍生多功能肽(VBM-DMP),利用合成的3条长引物片段,进行PCR扩增.克隆到pUC19载体,酶切和测序鉴定.亚克隆构建原核表达载体pGEX-4T-1-VBMDMP,IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物.用Glutathione Sepharose4B层析柱进行了亲和层析鉴定.将VBMDMP序列输入计算机,利用Antheprot软件分析.结果:血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)基因经限制性内切酶酶切和测序鉴定,其大小和核苷酸序列正确,与设计完全一致.获得了原核表达融合蛋白GST-VBMDMP.Antheprot分析显示,人IgG3上游铰链区连接后的Tumstatin的2个功能区域能自由伸展.结论:成功构建了血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体,并对其进行了空间结构分析.
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肿瘤血管生成抑制因子tumstatin的研究进展
肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成,通过抑制血管生成而切断肿瘤营养供给的方法一直是肿瘤生物治疗的研究热点.内源性新生血管抑制剂靶向性治疗肿瘤具有不产生耐药性、无毒副作用以及广谱性,故应用前景良好.肿瘤抑素(tumstatin)是新发现的来源于基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成的内源性抑制因子.本文就tumstatin在肿瘤生长、转移中的作用,及在肿瘤诊断研究中的意义、抗肿瘤血管生成基因治疗研究中的进展进行综述.
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tumstatin基因修饰巨核细胞联合化疗抑制肺腺癌小鼠皮下移植瘤生长
目的 探讨肿瘤抑素(tumstatin)转基因巨核细胞联合化疗对肺腺癌小鼠生存率的影响和皮下移植瘤生长的抑制作用.方法 制备tumstatin转基因巨核细胞,通过小鼠背部接种肺腺癌A549细胞,建立小鼠肺腺癌移植瘤模型.小鼠皮下瘤长径达到5 mm后随机分为4组:生理盐水对照组(A组,对照组),吉西他滨(GEM)化疗组(B组,单纯化疗组)、GEM联合巨核细胞组(C组)、GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组(D组);其中B、C、D三组为治疗组.对各组小鼠分别进行给药24 d,每3d测1次肿瘤体积.在治疗第15天眼球取血,通过血液分析仪检测血细胞值;第24天剥离瘤体,测量大小及质量,免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度(MVD),HE染色检测肿瘤组织坏死情况,治疗期间记录小鼠生存情况.结果 各治疗组肿瘤体积生长曲线显著慢于生理盐水组,其中D组瘤体生长慢且该组生存率较单纯化疗组(B组)得到明显提高;与其他三组相比,D组小鼠皮下瘤MVD受到显著抑制并引起肿瘤组织重度坏死,且相应小鼠体内保持较正常的血细胞水平.结论 tumstatin转基因巨核细胞联合化疗较单独化疗显著抑制肿瘤新生血管生长并可提升肺腺癌小鼠的生存率.
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Tumstatin转基因巨核细胞在NOD/SCID鼠体内产生抗新生血管作用血小板
目的：了解tumstatin转基因巨核细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷( NOD/SCID)鼠体内生成血小板情况及其抗新生血管作用。方法制备的tumstatin转基因巨核细胞注入NOD/SCID鼠体内，定期取血，通过流式细胞仪分析转基因血小板产生情况；激光共聚焦法检测血小板的tum-statin表达；内皮细胞管状结构形成试验检测血小板的抗血管生成作用；血小板聚集试验检测转基因血小板的聚集功能。结果 tumstatin转基因巨核细胞输注NOD/SCID鼠后的第3天，外周血可检测到人血小板；血小板表达tumstatin；这种转基因血小板可显著抑制内皮细胞管状结构形成并保持正常的聚集功能。结论 tumstatin转基因巨核细胞可在NOD/SCID鼠体内产生有抑制血管形成且保持正常聚集功能的血小板，为进一步抗肿瘤研究奠定基础。
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tumstatin基因修饰的CD34+造血干细胞生成抗血管生成活性的血小板
目的以慢病毒为基因载体,将tumstatin cDNA导入CD34+造血干细胞,在体外诱导生成tumstatin基因修饰的巨核细胞( MKs)和血小板,检测产生的血小板对血管内皮细胞管状结构形成的作用。方法构建 pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen重组载体后转染293T细胞进行病毒包装。用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集脐血中CD34+造血干细胞。用慢病毒感染CD34+造血干细胞,在细胞因子组合培养液中诱导MKs生成,流式细胞仪和形态学检测MKs的生成及产血小板情况。应用RT-PCR法和Western blot法检测tumstatin基因的表达,通过人脐静脉血管内皮细胞管状结构形成抑制试验研究血小板内容物生物学活性。结果选择佳感染复数(MOI)30：1感染干细胞时效率高；流式细胞术检测结果显示,细胞在诱导过程中,转染组与未转染组细胞都有MKs与血小板的生成,且生长速度和分化趋势基本相同。在转染的MKs基因组里,RT-PCR法检测到738 bp tumstatin基因片段。 Western blot法检测到tumstatin在转基因细胞来源的血小板中稳定表达,血小板可明显抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成。结论基因修饰的CD34+造血干细胞在体外成功诱导分化为MKs和血小板并表达tum-statin蛋白,且这种血小板在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成。
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新型内源性血管生成抑制剂Tumstatin
内源性血管生成抑制剂是抗血管生成治疗有潜力的药物蛋白.Tumstatin是近发现的一种新型高效的内源性血管生成抑制剂,可特异性地作用于内皮细胞,诱导内皮细胞凋亡,起到抗血管生成作用.现就其研究进展作一综述.
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Tumstatin肽对条件培养基下视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移的影响
目的 模拟糖尿病视网膜病变(DR)的体内环境,观察血管形成抑制因子Tumstatin肽(T8肽)对高糖视网膜Müller细胞条件培养基(HGMCM)诱导的视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移的影响.方法 采用细胞划痕实验,观察不同质量浓度的T8肽对HGMCM诱导的RF/6A细胞迁移的抑制作用.结果 加入不同质量浓度的T8肽后,RF/6A细咆24 h、48 h迁移的距离显著降低,迁移距离随着T8肽质量浓度的增大而逐渐降低(P＜0.01).结论 Tumstatin肽能够抑制HGMCM诱导的视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移,可能是Tumstatin肽抗血管生成的机制之一.
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两种源于胶原Ⅳ非胶原区具有抑制血管形成和肿瘤生长的功能肽
Tumstatin和Canstatin是继Restin、angiostatin和endostatin之后新发现的基底膜来源人胶原Ⅳ肿瘤血管生成抑制因子.Tumstatin来源于胶原Ⅳα3链,其N-端54～132氨基酸功能肽能够抑制内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡,N-端197～215氨基酸[α3(Ⅳ) NC1 185～203 氨基酸]功能肽能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖.Canstatin是来源于Ⅳ型胶原α2链的24 kD的血管生成和肿瘤生长抑制因子,它能剂量依赖性抑制内皮细胞管状结构的形成,有效抑制内皮细胞的增殖和迁移,并能诱导内皮细胞凋亡.在小鼠移植瘤模型体内实验中,Tumstatin和Canstatin都显示出对实体瘤生长的显著抑制作用.
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人tumstatin基因的克隆表达及其鉴定
目的 重组表达人tumstatin,为人tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础.方法 提取HEK293细胞总RNA,通过RT-PCR扩增人tumstatin基因,导入pMD19-T,测序,然后亚克隆至pET28a,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.结果 提取的总RNA经电泳,有清晰的28S和18S两条带.RT-PCR扩增产物长度与理论值750bp相一致.测序证实tumstatin基因正确插入载体中.重组人tumstatin在大肠杆菌中高效表达,表达量约占菌体总蛋白量的30%.Western blot证实所表达蛋白为目的 蛋白.结论 重组人tumstatin蛋白在大肠杆菌中高效表达,为进一步的tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础.
关键词： Tumstatin 肿瘤新生血管生成抑制因子 基因克隆和表达 -
Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增殖及ERK蛋白表达的影响
目的 观察Tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞增殖及细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达的影响.方法 采用MTY比色法测定Tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增殖的干预作用;采用Western-blot检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60 min的RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达水平的变化.结果 T8肽浓度在5μg/ml以上时对RF/6A细胞有抑制作用,且抑制作用随着浓度的增大而增高,各组A值和抑制率比较差异均有显著性(均P＜0.05);T8肽可抑制VEGF对RF/6A细胞的促增殖作用;在1～40μg/ml相同浓度条件下,T8肽对VEGF条件下的RF/6A细胞增殖抑制率显著大于无VEGF条件下的抑制率(均P＜0.01).VEGF可刺激RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达增加,T8肽可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞ERK1/2蛋白的表达.结论 Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖,机制可能与VEGF信号转导通路上的ERK1/2细胞信号转导通路有关.
关键词： Tumstatin 视网膜微血管内皮细胞 增殖 有丝分裂激活蛋白激酶类 -
Tumstatin:特异性内皮细胞蛋白合成抑制剂
研究已经证实无论是实体瘤还是血液系肿瘤的生长和转移都是血管依赖性的.肿瘤组织的血管新生主要取决于内皮细胞的增殖和凋亡间的平衡.新近发现的具有肿瘤抑制性的组织内源性的Tumstatin,还具有特异性内皮细胞蛋白质翻译合成抑制作用,进而促进内皮细胞的凋亡.
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Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响
目的 观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响,初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制.方法 采用细胞划痕实验测定tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下RF/6A细胞(恒河猴视网膜微血管内皮细胞)迁移的影响;Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化.结果 Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用,呈剂量依赖性.正常情况下,RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达,但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达(加入20mg/L T8肽30,45,60min时蛋白表达受到显著抑制,差异有显著性意义,P<0.01).结论 Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与P38MAPK通路有关.
关键词： Tumstatin 视网膜微血管内皮细胞 迁移 p38MAPK -
重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定
目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum-5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中,转化感受态细胞DHSα,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pQE-30-Tum-5,表达的蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum-5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.
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Tumstatin抑制肿瘤机制研究进展
自从1971年Folkman等[1]提出肿瘤生长和转移依赖于新血管生成,抑制肿瘤血管新生便成为一种潜在的肿瘤治疗方法.到目前为止已发现数百种新血管生成的抑制因子,其中部分已被FDA批准进入临床实验,取得良好的抑瘤效果.目前,一种新型的新血管生成抑制因子Tumstatin抑制肿瘤的机制受到广泛关注.现就Tumstatin的肿瘤抑制机制研究进展综述如下.
