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大鼠视网膜微血管内皮细胞的原代培养及鉴定改进
目的 探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞原代培养改进方法,为研究视网膜新生血管疾病的病理机制奠定基础.设计 实验研究.研究对象 大鼠视网膜微血管内皮细胞.方法 采用机械剪除大鼠视网膜血管联合酶消化分离,用含胎牛血清、内皮细胞培养特制添加剂等的条件培养基培养及纯化大鼠视网膜微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态.应用因子Ⅷ、血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)免疫鉴定细胞.主要指标 微血管内皮细胞形态,免疫荧光染色.结果 原代培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞贴壁后散在分布,呈单层排列,多为梭形,边界清楚,少量呈铺路石样螺旋向外生长,3～5天后融合,呈簇状单层分布.免疫荧光细胞染色显示,因子Ⅷ抗体染色核周出现黄绿色荧光反应,CD31因子抗体染色以胞浆着色为主.细胞纯度较高,荧光染色阳性细胞率为95％.结论 采用机械剪除大鼠视网膜血管、胰蛋白酶和胶原酶消化、含特制添加剂培养基的应用、明胶包被培养瓶等综合法可获得较纯的大鼠视网膜微血管内皮细胞.
关键词： 视网膜微血管内皮细胞 大鼠 细胞培养 -
丝裂原激活蛋白激酶信号通路抑制剂对高糖培养视网膜微血管内皮细胞的影响
目的 研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂对高糖培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMECs)的作用.方法 体外培养RMECs,将细胞分为5组:空白组、模型组、SB203580 ( p38抑制剂)组、U0126 (胞外调节蛋白激酶抑制剂)组和SP600125(应激活化蛋白激酶抑制剂)组,各抑制剂组加入相应抑制剂10 μmol· L-1预孵育1 h后,除空白组外,其他4组高糖处理24 h.以免疫荧光实验检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达分布,用实时荧光定量-聚合酶链式反应及免疫印迹法检测PPAR-γmRNA与蛋白的表达水平,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位( MMP).结果 空白组、模型组、SB203580组、U0126组和SP600125组的PPAR-γmRNA表达量比值分别为1.00 ±0.01,0.79 ±0.06,1.01 ±0.04,1.19 ±0.11 和0.73 ±0.12;这5组MMP分别为0.40 ±0.02,0.22 ±0.01,0.41 ±0.01,0.45 ±0.01 和0.21 ±0.01.模型组与空白组比较,上述指标均显著降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05);SB203580组和U0126组与模型组比较,上述指标均升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05);SP600125组与模型组比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05);抑制剂组中, U0126 组的上述指标升高显著,差异均有统计学意义(均P＜0.05). PPAR-γ的蛋白水平变化与mRNA水平变化一致.结论 在高糖环境中,抑制剂U0126可上调RMECs的PPAR-γ表达并减轻其线粒体损伤.
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三七总皂苷对高糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞损伤的保护作用
目的：观察三七总皂苷（ PNS）对高浓度葡萄糖致大鼠视网膜微血管内皮细胞（ RRCECs）损伤的保护作用和对细胞黏附分子－1（ICAM－1）的影响。方法体外原代培养RRCECs，并通过免疫荧光化学方法鉴定；用PNS作用于4～6代的RRCECs，实验分为正常组、高糖组（30 mmol／L）和高糖不同浓度PNS（20、50、100 mg／L）组，分别使用MTT比色法和台盼蓝计数法观察PNS对细胞活力及数目的影响，使用Western blotting检测药物作用前后ICAM－1的表达变化。结果 MTT比色法结果显示，PNS 50、100 mg／L作用48 h和72 h可明显减轻高糖造成的RRCECs损伤，提高RRCECs活力（P＜0．01）；台盼蓝计数结果显示，在PNS作用48 h后PNS 100 mg／L组细胞数目明显增加（P＜0．01），72 h后PNS 50、100 mg／L 组细胞数目均明显增加（ P＜0．05）。 Western blotting 检测显示，随着PNS药物浓度的增高，高糖环境下RRCECs中的ICAM－1表达量逐渐减少（ P＜0．05）。结论 PNS可以减轻高糖引起的RRCECs损伤，减少高糖环境下RRCECs中ICAM－1表达。 PNS对RRCECs的保护作用与ICAM－1表达调节之间的关系有待进一步研究。
关键词： 三七总皂苷 视网膜微血管内皮细胞 细胞间黏附分子-1 大鼠 -
牛蒡子总木脂素对大鼠视网膜血管内皮细胞迁移及VEGF表达的影响
目的:观察牛蒡子总木脂素(TLFA)对体外培养的视网膜微血管内皮细胞(RMECs)迁移及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响.方法:采用细胞划痕实验测定TLFA对SD大鼠RMECs迁移的影响,qRT-PCR检测TLFA刺激后RMECs的VEGF表达水平变化.结果:TLFA对SD大鼠RMECs迁移具有显著的抑制作用,且抑制作用的强弱呈剂量依赖性.TLFA对RMECs中VEGF mRNA表达的抑制作用呈浓度—时间依赖性.结论:TLFA抑制大鼠RMECs迁移的作用机制可能与其抑制VEGF mRNA的表达有关,它可能通过抑制VEGF的表达而抑制视网膜新生血管的形成.
关键词： 牛蒡子总木脂素 视网膜微血管内皮细胞 血管内皮生长因子 -
大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立
目的 应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(Retinal Microvascular Endothelial Cells,RMECs)血管形成的体外培养体系,为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础.方法体外培养RMECs,在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系.结果经分离培养的RMECs在Matrigel上培养形成管腔样结构.结论 RMECs能够在Matrigel上形成血管腔.
关键词： 视网膜微血管内皮细胞 细胞培养 血管形成 -
视网膜微血管内皮细胞在糖尿病视网膜病变中的研究现状
糖尿病视网膜疾病是导致成年人失明的主要因素,是糖尿病的一种令人恐惧的并发症,高血糖被认为是促进其发展的主要原因.高血糖不断地破坏视网膜的微血管系统终导致视网膜的许多代谢,结构和功能的紊乱.视网膜微血管内皮细胞在微脉管系统中形成树枝状供应视网膜神经,这些内皮细胞的解剖和生理符合重要视觉保护的营养需求[1].一方面,内皮组织务必确保氧的供应和代谢活跃的视网膜营养供应;另一方面,内皮细胞有助于血-视网膜屏障将循环产生的毒素分子,白细胞促炎性物质排出体外来保护视网膜,这种特性也可能会引起疾病,比如:视网膜血管的渗漏和新生血管,炎性物质转移,因此,视网膜内皮细胞在视网膜缺血性病变,血管炎中起到重要作用,包括糖尿病视网膜病变和视网膜炎症或感染尤其是后葡萄膜炎.使用基因表达和蛋白质组学分析等研究方法,有助于了解这些疾病的发病机制.为了进一步开展对糖尿病视网膜疾病的研究,有必要就目前有关糖尿病视网膜病变患者微血管内皮细胞的研究进展予以综述,旨在为糖尿病视网膜病变的深入研究提供参考依据.
关键词： 视网膜微血管内皮细胞 血管内皮生长因子 糖尿病视网膜病变 -
PEDF对大鼠视网膜血管内皮细胞迁移及VEGF表达的影响
目的:观察PEDF对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及VEGF蛋白表达的影响,初步探讨PEDF抗视网膜内皮细胞迁移的机制.方法:采用细胞划痕实验测定PEDF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移的影响;RT-PCR检测PEDF刺激后15,30,45,60min大鼠视网膜微血管内皮细胞的VEGF水平的变化.结果:PEDF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞促迁移作用,呈剂量依赖性.结论:PEDF抑制糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与VEGF水平有关.
关键词： 细胞色素上皮衍生因子 视网膜微血管内皮细胞 迁移 -
藏红花素对糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞凋亡的影响
目的 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGE)可引起细胞内产生过氧化物和炎症因子,导致视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cell,RMEC)凋亡,视功能破坏.文中观察藏红花素对在AGE作用下RMEC活性、凋亡比例、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产物、细胞内和上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α含量的干预,探讨藏红花素对AGE引起RMEC凋亡的保护机制.方法采用免疫磁珠法分离培养RMEC,浓度为10、50和100μmol/L藏红花素培养液作用于RMEC,观察4d内细胞增生变化并记录生长曲线.不同浓度藏红花素溶液作用于AGE处理的RMEC 12h,锥虫蓝染色计数活细胞率,流式细胞术检测凋亡细胞比例,荧光光度计测定细胞内ROS含量,采用蛋白电泳和ELISA测定RMEC内和上清中TNF-α含量.结果 RMEC在10、50μmol/L藏红花素的培养液中可以继续增生.培养至3d和4d时,100μmol/L藏红花素可使细胞增生受到抑制.与对照组相比,100mg/L AGE处理12h和24h后RMEC活细胞比例明显下降.10、50和100μmol/L藏红花素可不同程度保护AGE处理后RMEC活细胞比例.与对照组相比,100mg/L AGE处理12h后凋亡细胞比例明显升高.10、50和100μmol/L藏红花素处理12h后凋亡细胞比例均有下降.AGE处理12h后RMEC内ROS水平明显升高.10、50和100μmol/L藏红花素可不同程度抑制AGE处理后RMEC内ROS水平.AGE处理后RMEC内和上清液中TNF-α水平明显升高.10、50和100μmol/L藏红花素可明显抑制AGE处理后RMEC内和上清液中TNF-α水平.结论 藏红花素可能通过抑制AGE诱导RMEC中ROS产生并减少TNF-α合成途径,防止细胞凋亡.
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康柏西普对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞屏障功能及VEGF表达的影响
目的：探讨康柏西普对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞屏障功能及VEGF表达的影响。方法将人视网膜血管内皮细胞分为正常组（5.5 mol/L葡萄糖）、高糖组（25 mol/L葡萄糖）、高糖+不同浓度（25μg/L、2.5μg/L、0.25μg/L）的康柏西普组。应用酶联免疫吸附测定（ ELISA）检测各组细胞上清液中血管内皮生长因子（ VEGF）的浓度；跨膜电阻（ TER）及辣根过氧化物酶（ HRP）通透性的检测，以评价细胞屏障的稳定性；蛋白质印迹法（WesternBlot）检测紧密连接相关蛋白occludin的表达。结果 ELISA结果示：高糖组分泌的VEGF比正常组高，增加差异具有统计学意义（P﹤0.05），各康柏西普组能抑制高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞VEGF的分泌；Western blot示：25μg/L、2.5μg/L康柏西普组occludin蛋白表达量较高糖组高（ P﹤0.05），但0.25μg/L康柏西普与高糖组无明显差异（ P﹥0.05）；TER值、HRP通透性检测示：康柏西普能抑制高糖组TER值的降低，并抑制HRP通透性的增加。结论康柏西普对高糖环境下血视网膜内屏障具有一定的保护作用，其机制可能与VEGF有关。
关键词： 康柏西普 高糖 视网膜微血管内皮细胞 屏障功能 -
Sunitinib对视网膜微血管内皮细胞增殖和迁移的影响
目的 探讨苹果酸舒尼替尼(Sunitinib)对体外培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)增殖和迁移及KDRmRNA表达的影响.方法 选取不同浓度的Sunitinib作用于RF/6A,分别于培养24h和48h后采用SRB染色法观察不同浓度的Sunitinib对RF/6A增殖的影响;采用细胞划痕修复实验观察不同浓度的Sunitinib对RF/6A迁移的影响;同时利用RT-PCR法检测不同浓度的Sunitinib处理前后RF/6A KDR mRNA表达水平的变化.结果 Sunitinib对RF/6A的增殖有抑制作用且呈时间-剂量依赖性,0.00125 mg·L-1、0.002 5 mg·L-1、0.005 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1浓度的Sunitinib作用24 h,对RF/6A增殖的抑制率分别为(12.009±0.038)%、(21.440 4±0.007)%、(35.434±0.015)%、(43.125±0.002)%、(53.700±0.001)%、(60.971±0.003)%,各组两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01);而48h后,其抑制率则分别为(36.872±0.006)%、(40.673±0.013)%、(47.313±0.004)%、(55.910±0.003)%、(63.120±0.003)%、(69.975±0.014)%.各组两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01).培养基中加入0 mg·L-1、0.0025mg·L-1、0.005 mg·L-1、0.01 mg.L-1、0.02 mg·L-1浓度的Sunitinib 24 h后RF/6A的迁移距离分别为(203.3±2.2)μm、(145.4±4.4)μm、(123.9±2.6)μm、(96.1±3.1)μm、(46.6±2.9)μm.而48h后则为(313.1±4.1)μm、(213.9±2.8)μm、(193.9±4.2)μm、(134.5±3.2)μm、(109.9±5.7)μm.在同一时段,各组两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01).0mg·L-1、0.0025 mg·L-1、0.005 mg.L-1、0.01 mg·L-1、0.02 mg·L-1浓度的Sunitinib作用24 h后,RF/6A KDR mRNA的相对表达量分别为0.583±0.004、0.570±0.008、0.553±0.007、0.531±0.003、0.513±0.005.而48 h后则分别为0.628±0.005、0.610±0.002、0.588 4±0.002、0.564±0.005、0.525±0.004.在同一时段,各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.01).结论 Sunitinib能够抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖和迁移,其机制可能是通过下调VEGFR mRNA的表达来实现的.
关键词： 苹果酸舒尼替尼 视网膜微血管内皮细胞 增殖 迁移 -
7-二氟亚甲基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素拮抗高糖诱导视网膜微血管内皮细胞损伤的浓度效应
目的 探讨7-二氟亚甲基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethyl-5,4'-dimethoxygenistein,dFMGEN)拮抗高糖诱导猴视网膜微血管内皮细胞(retinal capillary endothelial cells,RCEC)损伤的浓度效应.方法 用不同浓度的dFMGEN和金雀异黄素(genistein,GEN)作用于高糖损伤的猴RCEC.测定各组乳酸脱氢酶活性,MTT法测定细胞增生抑制率,流式细胞术测定细胞凋亡率,观察不同浓度的dFMGEN及FEN拮抗高糖诱导RCEC损伤的浓度效应关系.结果 3.0 μmol·L-1和10.0 μmol·L-1dFMGEN组及GEN组细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为(106.600±1.172)U·L-1、(96.900±1.677)u·L-1、(99.400±1.113)U·L-1,细胞增生抑制率分别为29.9%、27.3%和29.1%,细胞凋亡率为(20.20±2.35)%、(9.27±1.30)%、(12.80±4.43)%,与高糖损伤组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).结论 dFMGEN能拮抗高糖诱导体外培养的RCEC损伤,并且在一定程度上较其先导化合物GEN所需的浓度低而作用更明显,这种拮抗作用呈明显的浓度依赖性.随浓度的提高作用越明显.
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重组canstatin蛋白抑制体外视网膜微血管内皮细胞的迁移和增殖
目的 观察重组血管能抑素(canstatin)蛋白对体外培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A)迁移、增殖及磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracelluar regulated protein kinases,pERK)、磷酸化Akt表达的影响,初步探讨重组canstatin蛋白抑制视网膜新生血管的作用机制.方法 体外培养RF/6A细胞系,在培养基中分别添加重组canstatin蛋白和等量的PBS,采用Transwell小室法检测各组发生迁移的内皮细胞并计数;铺Matri-gel胶,行体外成管实验,观察canstatin蛋白对内皮细胞成管的抑制作用;用MTT法检测重组canstatin蛋白对内皮细胞增殖的影响;Western blotting检测重组canstatin蛋白对血清刺激30 min后RF/6A细胞pERK、磷酸化Akt蛋白表达的影响.结果 加入重组canstatin蛋白后,显著抑制了细胞的迁移,重组canstatin蛋白组迁移的细胞数每视野(7.75±1.50)个显著低于PBS组(25.25±2.36)个(t=12.505,P=0.000);两组内皮细胞成管数分别为重组canstatin组每视野(18.67±7.02)个,也显著低于PBS组每视野(44.67±2.52)个(t=6.036,P=0.004).与PBS组相比,重组canstatin蛋白组的内皮细胞的增殖也受到抑制,后者48 h后平均吸光度A490为0.286 9±0.014 0,低于前者0.3349±0.021 7(t=3.723,P=0.01).同时,重组canstatin蛋白降低了RF/6A细胞中pERK蛋白的表达水平.结论 重组canstatin蛋白能通过下调pERK蛋白的表达抑制RF/6A细胞的迁移和增殖,具有潜在抑制视网膜新生血管形成的作用.
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糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞VEGF和ZO-1 mRNA合成的变化
目的 观察糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)作用下,大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMEC)的增生和活力的变化,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)合成和紧密链接蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)mRNA合成的变化.方法 采用免疫磁珠法分离培养rRMEC,0 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1和600 mg·L-1糖基化牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA)作用rRMEc,观察4 d内细胞增生变化,并采用台盼蓝染色法测定细胞活力.不同浓度的AGE-BSA(0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)作用12 h,100 mg·L-1的AGE-BSA作用不同时间(0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h)后,采用RT-PCR和Elisa测定rRMEC中VEGF mRNA、ZO-1 mRNA和上清中VEGF含量.结果 rRMEC在0 mg·L-1、10 mg·L-1和100 mg·L-1 AGE-BSA环境中可以继续增生,600 mg·L-1细胞增生可能受到抑制,造成rRMEC活力降低.在浓度为10～400 mg·L-1 AGE-BSA作用12 h时,VEGF mRNA合成增强,上清液中VEGF蛋白表达升高;在100 mg·L-1 AGE-BSA作用2～24 h,VEGF mRNA合成首先升高,后降低并趋于稳定;作用后各组均高于作用前(P＜0.01),上清液中VEGF蛋白表达随时间延长逐渐增加.随AGE-BSA浓度的增加,ZO-1 mRNA逐渐降低;随AGE-BSA作用时间的延长,ZO-1 mRNA逐渐降低.结论 在一定范围内,VEGF mRNA和ZO-1 mRNA合成呈AGE-BSA剂量和时间依赖性.VEGF可能是促进rRMEC ZO-1 mRNA合成降低的重要因素之一.
关键词： 视网膜微血管内皮细胞 糖基化终产物 血管内皮生长因子 紧密连接蛋白-1 大鼠 -
Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增生和迂移的影响
目的 探讨Tumstatin肽对视网膜血管内皮细胞增生和迁移的影响,了解其抑制血管生成的途径.方法 采用MTT比色法观察1 mg·L-1、5 ng·L-10、10mg·L-1、20 mg·L-1和40mg·L-1的Tumstatin肽(T8肽)对恒河猴视网膜血管内皮细胞(RG/6A细胞)增生的影响;采用流式细胞仪检测20 mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞细胞周期的影响;采用划痕修复实验观察0 mg·L-4、5 mg·L-1、10 ng·L-1和20 mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞迁移的影响.结果 5 mg·L-1以上浓度的T8肽对RF/6A细胞增生有抑制作用且呈荆量依赖性,1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1和40 mg·L-1浓度的T8肽抑制率分别为(2.69±1.10)%、(6.58±1.91)%、(16.77±3.05)%、(31.60±7.57)%和(40.05±8.43)%,各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).未加入T8肽时,RF/6A处于G0～G1期、S期和G2-M期的细胞比例分别为(43.66±1.37)%、(44.13±0.99)%和(12.21±0.39)%,而加入20mg·L-1的T8肽后则分别为(55.27±0.63)%、(28.51±0.68)%和(16.23±1.00)%,细胞凋亡率也由原来的0增加到(7.18±0.25)%,2组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01).培养基中加入0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1的T8肽后RF/6A细胞24 h的迁移距离分别为(248.09±2.28)c、(175.27±3.22)μm、(120.81±3.59)μm和(44.65±1.83)μm,而48 h时则为(393.68±2.21)μm、(341.62±4.27)μm、(254.65±2.93)μm和(118.69±5.96)μm,在同一时段,各组比较差异均有显著统计学意义(P＜0.01).结论 T8肽能够抑制RF/6A细胞的增生和迁移,使细胞阻滞于G0～G1期及诱导细胞凋亡是其抑制RF/6A细胞生长的原因.
关键词： Tumstatin肽 视网膜微血管内皮细胞 增生 迁移 -
15羟二十四碳四烯酸对缺氧视网膜微血管内皮细胞增生的抑制作用及其机制
背景 缺氧导致的视网膜新生血管性疾病已成为主要的致盲疾病,目前临床上缺乏有效的化学治疗方法,因此,研究其发病的分子机制从而指导临床用药十分关键. 目的 探讨15羟二十四碳四烯酸(15-HETE)对缺氧条件下培养的视网膜微血管内皮细胞(RMVECs)增生、凋亡的影响及其作用通路. 方法 分离C57BL/6J小鼠的RMVECs并用细胞除杂法进行培养,用间接免疫组织化学及免疫荧光检测法鉴定培养的细胞对内皮细胞的特征性标志物Ⅷ因子相关抗原的反应.将生长良好的细胞分为常氧组和缺氧组,后者以终浓度为125 μmol/L的CoCl2处理细胞建立缺氧模型.各组细胞换无血清含内皮细胞生长添加剂(ECGS)和高糖的DMEM培养基继续培养48 h,再按照培养基中加入15-HETE浓度的不同(终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0μmol/L)分别将常氧组和缺氧组细胞亚分为4个组.各组细胞分别用15-HETE处理48 h,然后用MTT法检测各组细胞的增生值(吸光度,A值),并计算15-HETE的抑制率;分别采用逆转录PCR(RT-RCR)法及Western blot法检测各组RMVECs中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、bcl-2和caspase-3 mRNA及其蛋白的相对表达量. 结果 间接免疫组织化学法检测结果显示,培养的细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,细胞阳性率为(94.38±4.25)％.常氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值(A值)的差异无统计学意义(F=0.283,P=0.837),但缺氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值的差异有统计学意义(F=702.582,P＜0.001),其中缺氧+1.0 μmol/L 15-HETE处理组、缺氧+5.0 μmol/L 15-HETE处理组RMVECs增生值明显低于单纯缺氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.05).0.1、1.0、5.0μmol/L 15-HETE处理组对RMVECs的抑制率分别为(1.09±0.31)％、(21.09±3.53)％和(49.86±4.15)％,随着15-HETE浓度的增加,抑制率逐渐升高.常氧条件下各组bcl-2、caspase-3和HIF-1α mRNA的表达差异均无统计学意义,与单纯常氧培养组比较,单纯缺氧培养组RMVECs中bcl-2和HIF-1α mRNA的相对表达量分别升高1.5倍和1.7倍,而caspasse-3 mRNA的表达降低了70％,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);在用不同浓度15-HETE干预的缺氧细胞中,bcl-2、HIF-1α的相对表达量随着15-HETE浓度的增高呈逐渐下降的趋势,而caspasse-3mRNA的表达则逐渐上升.常氧条件下各组细胞bcl-2、pro-caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(P＞0.05),但与单纯常氧培养组比较,单纯缺氧培养组bcl-2、pro-caspase-3蛋白相对表达量分别上升1.6倍和1.9倍,差异均有统计学意义(P＜0.05);在缺氧条件下,bcl-2和pro-caspase-3蛋白的表达量随15-HETE浓度的增高逐渐下降,5.0 μmol/L 15-HETE处理组分别是单纯缺氧培养组的40.4％和42.5％,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 15-HETE可能通过下调HIF-1α、bcl-2及激活caspase-3的方式抑制缺氧诱导下RMVECs的增生,从而对缺氧导致的新生血管生成产生抑制作用,其作用呈剂量依赖的方式.
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静态压力对大鼠视网膜微血管内皮细胞内皮素-1和NO表达的影响
目的 观察静态压力变化对大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMECs)形态、增生活性及分泌血管活性物质内皮素-1(ET-1)和一氧化氮合酶(NOS)的影响.方法 体外培养并鉴定大鼠RMECs,分为A(1.33kPa)、B(2.67kPa)、C(5.33kPa)和D(10.67kPa)组和未加压对照组.用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,常规方法 进行细胞计数,锥虫蓝染色检测活细胞比例.用Griess硝酸还原酶法检测NO代谢产物NO_2~-/NO_3~-的含量,放射免疫法检测培养细胞的ET-1蛋白表达;用RT-PCR法半定量研究RMECs中ET-1、eNOS、iNOS mRNA的表达.结果 B、C、D组RMECs细胞核膨大,胞体拉长,可见少量悬浮细胞;静态压力促进RMECs增生(F=12.205,P＜0.01),C组和D组细胞数量高于对照组、A组和B组(P＜0.01);静态压力升高造成各组细胞损伤,拒染率降低(F=11.180,P＜0.01),B、C、D组细胞拒染率低于对照组(P＜0.05).B、C、D组ET-1浓度较对照组增加(P＜0.01).C组和D组RMECs培养液中NO_2~-/NO_3~-浓度高于对照组(P＜0.01).B、C、D组RMECs中ET-1 mRNA表达较对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.01);C组和D组RMECs中eNOS mRNA和iNOS mRNA表达较对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 高静态压力可直接导致RMECs的结构损伤,高静态压力下RMECs合成ET-1、NO增多可能是高眼压眼底病变的机制之一.
关键词： 视网膜微血管内皮细胞 内皮素-1 一氧化氮 静态压力 青光眼 -
苦参碱对大鼠视网膜微血管内皮细胞的增生及VEGF表达的影响
目的 探讨苦参碱(Ma)对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增生抑制及对血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响.方法 原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞,噻唑蓝比色法(MTT)检测不同质量浓度的Ma对其增生的抑制作用.将培养的细胞分为对照组、Ma(40 mg/L)组、高糖(25 mmol/L)组、Ma+高糖组4组.免疫细胞化学和Western blot法检测细胞VEGF的表达.结果 一定质量浓度范围内Ma可抑制视网膜微血管内皮细胞的增生(P＜0.05),48 h内呈质量浓度依赖性.与对照组和高糖组相比,Ma组48 h后,VEGF表达明显下降(P＜0.05),与对照组相比,高糖组VEGF的表达明显增加(P＜0.05).结论 Ma可抑制视网膜微血管内皮细胞的增生,抑制主要是通过下调VEGF表达而发生作用的,Ma对高糖引起的VEGF表达上调同样也有抑制作用.
关键词： 苦参碱 视网膜微血管内皮细胞 血管内皮细胞生长因子 免疫细胞化学 免疫印迹法 -
银杏内酯B对高糖低氧诱导视网膜内皮细胞损伤的保护作用及其机制
目的:探讨银杏内酯B(Ginkgolide B,GKB)对高糖低氧所致人视网膜内皮细胞(human retinal endothelial cel ls,HREC)损伤的保护作用.方法:建立高糖低氧诱导HREC损伤模型,然后经CCK-8法筛选GKB的佳作用时间与浓度.ELISA检测TNF-α,ICAM-1,IL-6的水平来评估炎症反应;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western印迹检测PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性.结果:与正常对照组相比,高糖低氧模型组细胞活力显著降低,GKB处理可逆转高糖低氧所致的内皮细胞活力降低.高糖低氧模型组细胞的凋亡率显著增加,且细胞内炎症因子TNF-α,ICAM-1,IL-6的表达明显升高;而给予GKB处理后,细胞的凋亡率降低,TNF-α,ICAM-1,IL-6的水平部分回落.此外,高糖低氧模型组细胞中p-AKT,p-PI3K和p-mTOR表达降低;经GKB处理后细胞中p-PI3K,p-AKT和p-mTOR表达升高与蛋白的表达部分下降;给予AKT信号通路激动剂胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)可促进GKB的保护作用,并增加细胞活力.结论:GKB可显著对抗高糖低氧所致的视网膜内皮细胞凋亡损伤与炎症反应,其损伤保护作用可能与活化PI3K/AKT/mTOR信号通路有关.
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糖基化终末产物对体外诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞血管形成的影响
目的 应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞血管形成的体外培养体系,研究糖基化终末产物对诱导视网膜微血管内皮细胞血管形成的影响,从而探讨糖基化终末产物在糖尿病微血管病血管新生中的作用.方法 体外培养视网膜微血管内皮细胞,制备糖基化白蛋白.在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系,实验分浓度效应组和时间效应组,并进行CD34免疫细胞化学染色.采用光镜下计数管腔数及计算机图像分析对结果进行测定和分析.结果 经分离培养的视网膜微血管内皮细胞在Matrigel上培养形成管腔样结构.糖基化白蛋白(糖基化终末产物)作用于培养的视网膜微血管内皮细胞后,可见管腔形成数目增加,且在一定范围内呈时间和剂量依赖效应(P<0.01).结论 糖基化终末产物可以促进Matrigel体外诱导视网膜微血管内皮细胞的血管形成.
关键词： 糖基化终末产物 视网膜微血管内皮细胞 血管形成 -
缺氧条件下视网膜微血管内皮细胞中缺氧诱导因子1和血管内皮生长因子m RNA表达的研究
目的探讨视网膜微血管细胞在缺氧过程中缺氧诱导因子1(HIF1)和血管内皮生长因子(VEGF)基因mRNA水平表达的变化.方法视网膜微血管细胞(RECs)分别在正常氧、缺氧3 h不同条件下培养后,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法半定量测定HIF1α和VEGF基因的mRNA水平的表达.结果缺氧组RECs HIF1基因的mRNA水平表达为对照组的4.6倍.同时缺氧组RECs细胞的VEGF基因的mRNA水平表达为对照组的3倍.结论缺氧能引起视网膜微血管细胞的HIF-1及VEGF基因mRNA水平高表达提示缺氧可能通过HIF1基因的转录途径来诱发VEGF基因的高表达导致视网膜新生血管形成.
关键词： 缺氧 缺氧诱导因子1 血管内皮生长因子 视网膜微血管内皮细胞
