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人血管抑素K1-5重组腺病毒载体的构建
血管抑素K1-5是目前被认为强的抑制血管生成的因子之一,研究表明其能明显抑制血管内皮细胞增生及牵移.我们采用腺病毒作为载体,成功构建了携带血管抑素K1-5基因的腺病毒,为下一步进行体内外实验奠定了基础.
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杜氏盐藻叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD的构建
目的构建表达载体在杜氏盐藻叶绿体中表达重组人血管抑素(Angiostatin,ANG).方法利用基因工程技术将构建完整的人ANG基因插入到叶绿体启动子atpA5和终止子rbcL3′间,组成atpA-ANG-rbcL表达盒,将此表达盒与aadA表达盒串接后,插入含叶绿体同源片段的质粒载体p64上,构建成血管抑素盐藻叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD.结果酶切鉴定结果表明,2.2kb的ANG表达盒和1.9kb的aadA表达盒已按照预期顺序插入到质粒p64C上叶绿体chlL基因间.结论叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD可以应用于杜氏盐藻的叶绿体转化,表达重组人血管抑素.
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体外培养下可持续分泌人血管抑素和内皮抑素基因工程细胞对血管生成的抑制效应
背景:以往实验构建了可持续分泌人血管抑素和内皮抑素的基因工程细胞,即人血管抑素/293细胞和人内皮抑素293细胞,并已证明可持续分泌人血管抑素蛋白和人内皮抑素蛋白.但尚不了解其分泌物是否能发挥血管生成的抑制作用.目的:观察以基因工程技术构建的人血管抑素/293细胞和人内皮抑素,293细胞对鸡胍尿囊膜血管新生的抑制效应.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-0612007-01在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成.材料:Hek/293细胞为人胚胎肾细胞,由解放军军事医学科学院提供.人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞由课题组前期构建.SPF级鸡胚购自北京维通利华实验动物有限公司.方法:将鸡胚消毒后,置于37℃无菌恒温箱中孵育5 d,在距胚头1 cm两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位磨切暴露尿囊膜,制成假气室,用无菌滤纸封闭窗口.制成鸡胚尿囊膜模型,备用.用灭菌蒸馏水配制体积分数为0.5%甲基纤维素溶液,制成甲基纤维素小杯.卵壳开窗后第3天,分别吸取浓缩的293细胞、人血管抑素/293细胞、人内皮抑素/293细胞培养上清液各20 μ L.或人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞培养上清液各10 μ L,加于甲基纤维素小杯中,将其置于鸡胚 尿囊膜的两条大血管之间的无血管区.主要观察指标:观察尿囊膜血管生成的变化.结果:共培养9 d时,与单纯293细胞上清液组相比,人血管抑素/293细胞上清液或人内皮抑素/293细胞上清液组,甲基纤维素小杯内及邻近区的鸡胚尿囊膜血管明显发育不良,血管分布稀疏,数量明显减少,其一级血管数量盟未明显减少,但其管径较细,而二级血管和二级以下的血管数量明显减少、管径明显变细,伸入尿囊膜边缘区的血管数量减少,管径明显变细.与人血管抑素/293细胞组或人内皮抑素/293细胞组相比,人血管抑素/293细胞+人内皮抑素/293细胞组的一级血管数量和管径未见明显变化,而其二级血管和三级以下血管数量明显减少,血管树消失.结论:人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞的分泌物对鸡胚尿囊膜的血管新生均具有明显的抑制作用,且联合用药抑制作用增强.
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人尿血管抑素测定方法的建立及在肿瘤患者中的应用
目的:建立一种测定人尿液中血管抑素的方法,并探讨其在肿瘤患者中测定的意义.方法:依据ELISA的原理和技术要求,以赖氨酸作固相包被物,血管抑素为标准品,抗人K1～3的单抗为特异性的一抗,制备测定血管抑素的ELISA试剂盒.用此方法测定40例健康人(正常对照组)、92例恶性肿瘤(31例肺癌、31例食管癌、30例乳癌)患者治疗前尿中血管抑素含量.结果:该ELISA方法检测人尿中血管抑素的检出范围为1～200μg/L.正常对照组中尿血管抑素含量为0～27.4μg/L,x±s(16.15±6.82)μg/L.3种肿瘤患者尿中血管抑素平均水平均高于正常对照组(P＜0.05),肺癌、食管癌、乳癌的诊断符合率分别为77.4%、71.0%和70.0%,其间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:该方法操作方便,敏感性、特异性高;人尿中血管抑素含量检测可用于某些肿瘤的检出.
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人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究
目的:探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素(rhAGN)的影响.方法:应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及pH、通气量等对rhAGN表达量的影响.结果:(1)工程菌E.coli DH5α(pBVA2)在30℃培养至A600nm为0.3～0.5时于42℃诱导4 hrhAGN表达量高,约为212mg/L;(2)15 L发酵罐发酵参数为pH7.2,搅拌转速500r/min,通气量4～8L/min,溶氧50%时,rhAGN表达量提高到276mg/L.结论:确定了适诱导时机和诱导时间,通过调节pH和改善通气,初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺.
