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OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用
目的 构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用.方法 设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒.应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用.结果 成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒.该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.05).结论 成功构建的LV-siRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖.
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异硫氰酸苯乙酯通过PI3K-NF-κB-MMP-9途径抑制结肠癌SW480细胞的迁移和侵袭
目的 观察异硫氰酸苯乙酯(PEITC)对结肠癌细胞SW480增殖侵袭的分子机制.方法 体外培养结肠癌细胞系SW480,分别用10,30和50 μmol/L PEITC作用24h,MTr法检测细胞的增殖;伤口愈合实验和侵袭实验分别检测PEITC对SW480细胞迁移与侵袭的影响.荧光共振能量转移法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性,RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达情况;Westem blot检测PI3K和PTEN的表达和Akt、mTOR磷酸化,以及NF-κB核转位情况.荧光素酶报告基因分析NF-κB的活性.后,建立裸鼠异种移植瘤动物模型,观察PEITC对异种移植瘤生长的抑制作用.结果 PEITC能在不影响细胞活性的条件下显著抑制SW480细胞侵袭和迁移(P＜0.05),也能抑制MMP-9的酶活性以及mRNA表达(P＜0.05).同时PEITC能抑制PI3K的表达以及抑制Akt和mTOR磷酸化(P＜0.05),上调PTEN表达.PEITC也能抑制NF-κB核转位,并能降低其活性(P＜0.05).此外,PEITC也能抑制裸鼠异种移植瘤的生长(P＜0.05).结论 PEITC是一种潜在的抗结肠癌细胞转移药物,它可能通过影响PI3K/Akt和NF-κB通路发挥作用.
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亚硒酸钠诱导结直肠癌SW480细胞系凋亡
目的 探讨亚硒酸钠诱导结直肠癌SW480细胞凋亡的信号通路.方法 将SW480细胞分为三组,分别进行亚硒酸钠、MnTMPyP以及两者联用处理;用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧;Western blot方法检测细胞信号通路JNK和ATF-2的磷酸化,以及c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2等相关蛋白表达;流式细胞术检测SW480细胞凋亡率.结果 亚硒酸钠可使SW480细胞产生活性氧;抑制JNK和ATF-2的磷酸化(P＜0.05),下调c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2的表达诱导SW480细胞凋亡(P＜0.05);用活性氧抑制剂MnTMPyP可减轻亚硒酸钠所致的上述变化(P＜0.05).结论 亚硒酸钠可通过产生活性氧,抑制JNK和ATF-2的磷酸化,下调c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2的表达,促进SW480细胞的凋亡.
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幽门螺杆菌过氧化氢酶对SW480细胞中NF-κB和ERK通路的影响
目的 观察重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)过氧化氢酶(catalase,CAT)对SW480细胞内核转录因子(nuclear factor,NF)κB和细胞外信号调节激酶(extrocellular-signal regulated protein kinase,ERK)通路的影响.方法 用脂多糖(LPS)刺激SW480细胞,再用CAT预孵育和处理;采用免疫组织化学方法检测细胞内NF-κKB的表达水平,应用Western blot方法检测细胞质内IκB的蛋白表达量,电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)观察NFκB的激活;应用激光共聚焦显微镜和Western blot方法观察ERK的核内外易位及磷酸化.结果 重组Hp CAT与商品化CAT的作用相同,预孵后,NF-κB的表达和激活较LPS组和处理组明显减少,ERK核内易位和磷酸化亦明显减少,但较正常对照组仍明显增加.结论 Hp CAT能够抑制NF-κB和ERK通路.
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Bmi-1基因的过表达对人结肠癌细胞株SW480/CD133+细胞增殖的影响
目的 探讨Bmi-1基因过表达对人结肠癌细胞株SW480/CD133+细胞增殖的影响.方法 用携带Bmi-1基因的质粒(pMSCV-Bmi-1)感染人结肠癌SW480/CD133+细胞,作为观察组(pMSCV-Bmi-1/CD133+组);以空质粒(pMSCV)感染SW480/CD133+细胞,作为空质粒对照组(pMSCV/CD133+组);空白对照组不作任何处理,常规培养.用实时荧光PCR和免疫印迹法分别检测细胞中Bmi-1 mRNA水平和蛋白表达的水平;平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化.结果 观察组Bmi-1 mRNA和蛋白表达的水平均较空质粒对照组和空白对照组显著增高(均P＜0.01).观察组、空质粒对照组和空白对照组的细胞克隆形成率分别为(88.45±5.79)％,(52.33±3.62)％和(54.66±4.03)％,观察组分别高于空质粒对照组和空白对照组(均P ＜0.01).结论 成功地将Bmi-1基因导入SW480/CD133+细胞,并能使其在mRNA水平和蛋白水平稳定、持续地表达.Bmi-1过表达可以显著增强人结直肠癌SW480/CD133+细胞的克隆形成能力,促进SW480/CD133+细胞增殖.
关键词： 结肠癌 B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区-1基因 SW480细胞 增殖 -
Prdx2基因表达情况对结直肠癌SW480细胞影响作用分析
目的 探讨硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prdx2)基因表达对结直肠癌SW480细胞增殖、侵袭及凋亡的影响.方法 采用慢病毒空载体(空白组)、干扰片段(Prdx2-shRNA)慢病毒载体转染结直肠癌SW480细胞(实验组),野生型结直肠癌SW480细胞作为对照组,分别于转染后培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h采用MTT法检测SW480细胞增殖情况,采用流式细胞仪技术检测培养120 h后细胞的凋亡率,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRt-PCR)及Western-blot法检测Prdx2、Survivin mRNA及蛋白的表达,采用Transwell侵袭实验检测SW480细胞的侵袭能力.结果 实验组的W480细胞凋亡率显著高于空白组和对照组(P <0.05),培养48 h、72 h、96 h、120 h,实验组的W480细胞增殖能力明显低于空白组和对照组(P <0.05),实验组的SPrdx2、Survivin mRNA及蛋白相对表达水平显著低于空白组和对照组(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示,实验组的转染结直肠癌SW480细胞侵袭能力强于空白组和对照组(P <0.05).结论 Prdx2基因沉默会抑制结直肠癌SW480细胞的增殖、促进凋亡,但是会增强结直肠癌SW480细胞的侵袭能力.
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槲皮素对人结肠癌细胞SW480基质金属蛋白酶及组织蛋白酶-D的作用
目的 观察槲皮素对人结肠癌SW480细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)的影响;观察槲皮素对人结肠癌SW480细胞组织蛋白酶-D表达的影响.方法 酶谱分析技术观察槲皮素对人结肠癌SW480细胞MMPs分泌的影响;运用免疫组织化学方法观察槲皮素对人结肠癌SW480细胞组织蛋白酶-D表达的影响.结果 酶谱分析法检测显示不同浓度的槲皮素能够抑制人结肠癌SW480细胞分泌MMP-2及MMP-9,随浓度的升高,MMP-2及MMP-9的分泌量减少;免疫组织化学法显示不同浓度的槲皮素处理人结肠癌SW480细胞后,组织蛋白酶-D的表达随药物浓度的升高和作用时间的延长而降低.结论 不同浓度的槲皮素能够抑制人结肠癌SW480细胞MMP-2和MMP-9的分泌及组织蛋白酶-D的表达,这些都可能是槲皮素抑制结肠癌细胞侵袭和转移的原因.
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槐耳清膏对缺氧结肠癌SW480细胞VEGF及HIF-1α表达的影响
目的: 观察槐耳清膏对体外培养人结肠癌SW480细胞系VEGF和HIF-1α表达的影响.方法: 体外培养人结肠癌SW480细胞48 h, 随机分为常氧对照组(NC组)、低氧对照组(HC组)和低氧槐耳组(HH组), HH组RPMI 1640培养基含槐耳清膏(终浓度1 g/L). 半定量RT-PCR检测SW480细胞VEGF和HIF-1α mRNA表达水平, Western blot检测两者蛋白表达水平.结果: HH组和HC组VEGF、HIF-1α mRNA表达水平均显著高于NC组(4.71±0.07, 4.54±0.02 vs 1.19±0.03;5.68±0.07, 5.58±0.05 vs1.21±0.05, 均P<0.05), 但HH组与HC组比较无统计学差异. HC组VEGF、HIF-1α蛋白表达均显著显著高于NC组(0.66±0.03 vs 0.38±0.02;0.58±0.04 vs 0.31±0.03, 均P<0.05), 与HC组比较, HH组VEGF和HIF-1α蛋白表达均显著下降(0.37±0.03, 0.30±0.05, 均P<0.05).结论: 槐耳清膏通过下调人结肠癌SW480细胞内HIF-1α和VEGF蛋白表达抑制肿瘤生成.
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EGCG对LoVo和SW480结肠癌细胞株的作用及对Notch1与Notch2基因表达的影响
目的:探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对结肠癌细胞株LoVo细胞和SW480细胞增殖的抑制作用,研究其对Notch1与Notch2的基因表达的影响,方法:体外培养LoVo细胞和SW480细胞,采用不同浓度的EGCG(10、20、35 mg/L)对其进行干预,MTT法检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞增殖的抑制作用；用流式细胞仪检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞细胞凋亡和细胞周期的影响.实时荧光定量PCR检测EGCG干预后的LoVo细胞和SW480细胞的Notch1与Notch2基因的表达情况,结果:MTT法检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞增殖均具有抑制作用,且呈浓度依赖性,不具有时间依赖性.流式细胞仪检测EGCG能增强LoVo细胞和SW480细胞的凋亡率,且剂量与凋亡率呈正相关.EGCG能将SW480细胞和LoVo细胞周期阻滞在G0/G1期,阻碍其向S期转换,抑制其细胞增殖.实时荧光定量PCR检测EGCG能下调两株细胞Notch2的基因表达,而SW480细胞的Notch1基因表达有下调的趋势,LoVo细胞的Notch1基因表达有上调的趋势,但差异均无显著意义,结论:EGCG对体外培养的LoVo细胞和SW480细胞的增殖有明显抑制作用,且能诱导细胞凋亡和影响细胞周期,其作用机制可能与下调Notch2的基因表达及激活Notch信号转导途径有关,但是EGCG对Notch1基因表达的影响尚需要做进一步探讨.
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ALA-PDT诱导SW480细胞凋亡和胞内Ca2+浓度变化的关系
目的:探讨ALA-PDT诱导人结肠癌细胞SW480凋亡和游离钙浓度变化关系.方法:将SW480细胞分为四组:空白对照组、激光照射照组、ALA组和ALA-PDT组,用DNA片段分析和TUNEL法检测细胞凋亡;用激光共聚焦显微镜观测各组细胞内游离钙离子浓度的变化.结果:ALA-PDT组的人结肠癌细胞在1、2 h有大量的DNA片段,TUNEL法显示ALA-PDT组的人结肠癌细胞在PDT后30 min AI为25.26±5.04%,PDT后60 minAI为50.45%±7.85%,均高于其他3组(AI均＜10%,P＜0.01);激光共聚焦结果为ALA-PDT组细胞内游离钙离子浓度在20 min达高峰(荧光强度:185.40±18.90),与10 min(荧光强度:100.00±19.83)相比有显著差异(P＜0.01),之后又逐渐下降.结论:细胞内Ca2+浓度的逐渐增加在PDT诱导的细胞凋亡过程中可能起着重要作用.
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Embelin对大肠癌细胞株SW480细胞增殖和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体敏感性的影响
Embelin是从植物Embelia ribe中提取的具有抗肿瘤、抗炎等生物活性的化合物,可通过与X连锁凋亡抑制蛋白(X chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)蛋白BIR3功能域的结合阻止XIAP抑制caspase的活性[1].本研究首先观察embelin本身对大肠癌细胞株SW480增殖和凋亡的影响,并初步分析其作用机制.此外,embelin作为XIAP的拮抗剂和可能作用于多个分子靶点的植物提取物,研究其能否有效增强肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)诱导SW480细胞的凋亡性死亡.
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单壁碳纳米管对结肠癌细胞系SW480生物学行为影响研究
目的 单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNT)作为一维纳米材料具有良好的稳定性与光吸收能力且易倍修饰等特点,已被广泛用于癌症治疗、药物转运等领域.本研究探讨SWCNT对结肠癌细胞系SW480细胞增殖、凋亡和侵袭能力影响,为单壁碳纳米管临床应用提供帮助.方法 低、中和高浓度SWCNT分别与结肠癌细胞系SW480共孵育.CCK-8检测SW480细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力以及共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察SWCNT在SW480细胞内的定位;同时分析相关机制.结果 随着SWCNT浓度升高,SW480细胞存活力和细胞侵袭数量依次显著降低,高浓度SWCNT组细胞存活率[(21.43±2.44)％]和侵袭细胞数量(58.34±4.11)低,显著低于其他组,F值分别为157.094和203.749,多组间差异分析及两两比较均为P＜0.05.随SWCNT浓度升高,SW480细胞凋亡比例依次显著升高,高浓度SWCNT组细胞凋亡率高达(74.26±6.89)％,显著高于其他组,F=115.752,多组间差异分析及两两比较均为P＜0.05.而随SWCNT浓度的升高,G1期受阻SW480细胞比例依次显著增加,高浓度组高,F=21.293,多组间差异分析及两两比较均为P＜0.05.CLSM显示,SWCNT与SW480细胞线粒体共定位,SWCNT处理后SW480细胞线粒体出现断裂.结论 SWC-NT能够抑制SW480细胞分裂、增殖及迁移,促进细胞凋亡同时引起线粒体断裂.
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咪达唑仑下调USP22抑制结肠癌SW480细胞增殖
目的 探讨咪达唑仑(midazolam)抑制人结肠癌SW480细胞增殖的可能机制.方法 不同浓度咪达唑仑处理SW480细胞后,甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)及BrdU掺入比色法检测细胞活性和增殖情况,Western blot及RT-PCR检测USP22蛋白及mRNA表达;构建USP22干扰稳定细胞株,沉默USP22表达,Western blot检测USP22及细胞周期相关蛋白的表达水平.结果 咪达唑仑呈时间和剂量依赖性抑制SW480细胞增殖.咪达唑仑浓度依赖性抑制USP22表达.si-USP-22能有效干扰USP-22蛋白及mRNA水平的表达,达到沉默USP-22的效果.干扰USP22后,肿瘤细胞增殖受抑制,CDK抑制蛋白P21及P27表达上调,干扰USP22可能通过CDKI/RB通路介导SW480细胞增殖抑制.结论 咪达唑仑抑制人结肠癌SW480细胞增殖,可能机制为其下调USP22,通过CDKI/RB通路介导SW480细胞增殖抑制.
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靶向EZH2基因的短发夹RNA表达载体的构建及其对人结肠腺癌SW480细胞的增殖抑制作用
目的 构建靶向EZH2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探讨抑制EZH2基因表达对结直肠癌细胞增殖的影响.方法 根据EZH2 cDNA序列设计具有短发夹结构的DNA序列,构建重组表达载体,鉴定后转染至SW480细胞.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EZH2基因的抑制效果,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测EZH2抑制对SW480细胞增殖的影响.结果 EZH2基因shRNA表达质粒转染48 h后,基因沉默组和阴性对照组细胞中EZH2mRNA的相对表达水平分别为0.339±0.013和1.968±0.072,EZH2蛋白的相对表达水平分别为0.229±0.008和1.168 ±0.053,基因沉默组均明显低于阴性对照组(P＜0.01,P＜0.05).转染后48、72 h,细胞生长抑制率分别为30.7％和25.9％,与空白对照组比较细胞生长受到明显抑制(P＜0.05).结论 靶向EZH2基因的shRNA重组表达载体构建成功,并能显著抑制EZH2基因的表达.沉默EZH2基因能明显抑制结直肠癌细胞的增殖.
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Rac1活化在大肠癌细胞SW480迁移侵袭中的作用
目的 研究Rac1的活化在大肠癌迁移侵袭中的作用.方法 对大肠癌SW480细胞株,分别导入活化的Rac1 L61重组体和对照用质粒;采用配体结合免疫共沉淀法通过Western blot检测细胞中活化Rac1的含量,进一步用Transwell小室研究具有不同活性Rac1的SW480细胞其迁移及侵袭能力.结果 SW480细胞的转染效率高达80%以上,配体结合免疫共沉淀结果显示,转染Rac1 L61重组体后Rac1的活性显著高于对照组;应用Transwell小室对SW480细胞迁移及侵袭能力研究时,发现Rac1活性高的实验组迁移及侵袭的细胞数显著高于对照组(迁移细胞数43±9:22±5,P＜0.01;侵袭细胞数73±13:38±1,P＜0.01).结论 Rac1的活化在大肠癌迁移侵袭中起重要的作用.
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白介素-18基因修饰SW480细胞肿瘤原性改变及抗瘤作用研究
白介素-18(Interleukin-18,IL-18)能诱导T细胞和NK细胞产生IFN-λ,是参与启动细胞免疫反应的重要细胞因子,具有显著的抗肿瘤效应[1].
关键词： 人白细胞介素-18基因 SW480细胞 -
AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响
目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.
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前列腺素E2对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响
目的 研究前列腺素E2(PGE2)对结肠癌SW480细胞黏附、迁移、侵袭能力的影响及其可能的分子机制.方法 分别使用外源性PGE2及其受体EP1的拮抗剂SC19220作用于SW480细胞后,MTr法测定肿瘤细胞黏附能力,transwell小室检测细胞迁移及侵袭能力,RT-PCR及Western blotting检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白水平的改变.结果 外源性PGE2可以显著增加SW480细胞黏附、迁移及侵袭能力,PGE2作用于细胞后,黏附细胞A值由0.207±0.009增加至0.417±0.088,迁移细胞由6.33±0.33增加至43.33±0.88,侵袭细胞由3.67±0.34增加至26.33±0.89,差异均有统计学意义(P＜0.05).SC19220可抑制PGE2所诱导的SW480细胞黏附、迁移及侵袭,PGE2+SC19220组与PGE2组相比,黏附细胞A值由0.417±0.088下降至0.140±0.006,迁移细胞由43.33±0.88下降至28.00±0.58,侵袭细胞由26.33±0.89下降至5.67±0.33,差异均有统计学差异(P＜0.05).RT-PCR及Western blotting检测结果显示,PGE2作用后SW480细胞VEGFmRNA及蛋白水平表达增强,且表达量与PGE2浓度呈正相关.结论 PGE2可显著增加SW480细胞黏附、迁移及侵袭能力,其作用过程可能与VEGF表达上调相关.
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阿霉素对sw480细胞端粒酶活性的影响
目的 观察不同浓度阿霉素对大肠癌sw480细胞端粒酶活性的影响,探讨不同阿霉素作用浓度与端粒酶活性之间的关系,进而探讨阿霉素通过稳定G-四联体达到抑制肿瘤细胞增殖的可能性.方法 培养sw480细胞,取对数生长期sw480细胞制成不同浓度细胞悬液,通过MTT法测定不同浓度阿霉素对sw480细胞的增殖抑制率;通过PCR-TRAT-Elisa检测不同浓度阿霉素作用下大肠癌sw480细胞的端粒酶活性.结果 MTT结果显示,阿霉素抑制sw480细胞增殖具有浓度和时间依赖性;随着阿霉素处理作用时间延长,实验组细胞端粒酶活性逐渐降低,72h后达到低.结论 阿霉素抑制sw480细胞端粒酶活性具有明显的时间和浓度依赖性,其机制可能与阿霉素稳定G四联体有关.
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华蟾素对人结肠癌SW480细胞增殖的影响及其作用机制研究
目的 研究华蟾素(CINO)对人结肠癌SW480细胞增殖的影响及其作用机制.方法 体外培养SW480细胞,取对数期细胞以4×103个/孔接种于96孔板中,用培养液定容至总体积200 μL,随机分为四组:空白对照组(Control组,200 μL培养基)和CIN0 1 mg/mL组(用培养基稀释500倍取200 μL)、CIN0 10 mg/mL组(用培养基稀释50倍取200 μL)、CIN0 100 mg/mL组(用培养基稀释5倍取200 μL),采用MTT法检测CINO对SW480细胞的生长抑制作用,倒置荧光显微镜实时成像技术观察SW480细胞凋亡形态,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测CINO对SW480细胞血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)表达的影响.结果 作用24、48、72 h后,MTT结果显示CIN0 1、10、100 mg/mL组A540值均较Control组显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05).作用0、24、48 h后,倒置荧光显微镜观察CINO组(1、10、100 mg/mL)细胞凋亡数明显多于空白对照组.ELISA结果显示,CINO组能减少SW480细胞VEGF及VEGF-R2的蛋白表达,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CINO能抑制结肠癌细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与抑制肿瘤细胞自分泌VEGF、VEGF-R2有关.
