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携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建
目的 采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具.方法 将pTurboRFP-N上的含红色荧光蛋白基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N.用I-CeuI/PI-Scel双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5'040 pkGFP-Ⅱ,回收目的 片段,连接,获得重组腺病毒载体pH5′.040.CMV.RFP-N.将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒.通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况.扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度.结果 经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5′.040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的 基因；扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1012vp/mL,滴度达1×1010pfu/mLo结论 成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具.
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温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子调控条件的优化
目的 构建大肠埃希菌BL21 Mn-SOD-RFP报告基因载体,并探讨温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子的调控.方法 利用重组PCR技术,构建以Mn-SOD启动子调控的红色荧光蛋白(RFP)报告基因载体,将融合基因与T载体连接导入大肠埃希菌中,在不同温度(20、37、40和45℃)培养不同时间(13、20、30、37、44和54 h)后,利用荧光显微镜和荧光光度计观察大肠埃希菌表达RFP的情况.结果 正确构建Mn-SOD-RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致；不同温度不同时间诱导后,Mn-SOD启动子在37℃,培养30～ 37 h表达的红色荧光蛋白多.结论 成功构建该报告基因载体,并完成温度、时间对其调控的优化,为更进一步研究其他因素对SOD基因启动子的调控机制奠定基础.
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抗菌肽PR-39重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定
目的 构建抗菌肽PR-39(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)重组腺病毒表达质粒.方法 从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测.将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平.结果 重组腺病毒穿梭质粒pAd-Trace-TO4-PR-39经Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经Pac Ⅰ酶切鉴定,证明目的基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010 IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP; PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录.结论 已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达.
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hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达
目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础.方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1 (+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1 (+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达.结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1 (+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确.转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达.结论:成功构建了pcDNA3.1 (+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础.
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荧光蛋白在肿瘤示踪研究中的应用
1 荧光蛋白槪况目前在医学研究领域引用的荧光蛋白主要有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)两种.
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表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析
本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性.用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达.收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力.将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析.结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVB VP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位.本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定.随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株.因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定.
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人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达
目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达.方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况.结果:BT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGN cDNA全长897 bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGN cDNA序列一致.经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株.激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达.结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达.
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红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立
背景与目的:活体动物体内光学成像(opticalin vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术.生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点.本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体.方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠.结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果.此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达.RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异.结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪.
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表达红色荧光蛋白DsRed报告基因的逆转录病毒载体的构建和在肝干细胞体内示踪中的应用
目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究.方法:将pDsRedl 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体.将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67细胞系.结果:利用PT67细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝原始细胞系.将这些DsRed标记的肝原始细胞移植到小鼠损伤肝脏中,4周后可以在再生肝脏中清晰地观察到具有红色荧光的外源细胞.结论:由于肝脏组织没有红色自发荧光,用DsRed标记肝原始细胞进行肝内示踪时背景干扰小.
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白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用
目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向.方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbDsRed),并利用报告载体标记的肝干细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)观察了悬浮培养时LEPCs的分化去向.结果:白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向.结论:双色荧光蛋白报告载体的成功构建为研究LEPCs的分化、筛选可诱导LEPCs定向分化的分子提供了便捷的工具.
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不同剂量BMSC尾静脉输注对小鼠肺组织纤维化的影响
目的 研究经尾静脉输注不同剂量的骨髓间充质干细胞(BMSC)对小鼠肺纤维化的影响.方法 体外培养雄性转红色荧光蛋白(RFP)基因FVB小鼠BMSC.将24只FVB雌性受体小鼠随机分为正常组、模型组、BMSC治疗1组(BMSC 1组)和BMSC治疗2组(BMSC 2组)(n=6).模型组、BMSC 1组和BMSC 2组小鼠分别经气管内注射博莱霉素制备肺纤维化模型.建模24 h后,BMSC 1组和BMSCs 2组小鼠分别经尾静脉注射BMSC 1×10~6/只和2×10~6/只.于建模后第21天处死所有小鼠,制备小鼠肺组织标本.光学显微镜观察病理学变化;激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法进行RFP(+)BMSC分布观察和RFP定量分析;免疫组织化学法检测肺表面活性物质蛋白A(SP-A)表达;碱水解法测定羟脯氨酸(Hyp)含量;Real-time PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)和血小板衍生生长因子(PDGF)mRNA表达.结果 小鼠肺组织纤维化程度,BMSC 1组较模型组显著减轻,而BMSC 2组较模型组明显加重.BMSC 2组在肺间质纤维化活跃区域可见大量RFP(+)BMSC且其形态类似成纤维细胞.SP-A表达,正常组＞BMSC 1组＞BMSC 2组和模型组(均P<0.05),而BMSC 2组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05).Hyp含量,正常组＜BMSC 1组＜模型组＜BMSC 2组(P<0.01,P<0.05);TGF-β和PDGF mRNA表达,BMSC 2组＞BMSC 1组＞模型组＞正常对照组(均P<0.05).结论 适量的BMSC尾静脉输注能有效减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化,而过量的BMSC则可能使其病变加重.
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含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6构建
目的 构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究.方法 质粒pDsRed2-N1 中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6,得到pDsRed2-SilencerU6质粒,利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞,荧光显微镜、FACS检测转染效率.结果 DsRed2蛋白编码基因序列BbsⅠ点突变正确,成功构建pDsRed2-SilencerU6载体,其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白,利用脂质体转染技术,转染效率达70.61%.结论 成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达,为今后开展RNA干扰研究提供了基础.
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P-选择素凝集素样结构域和红色荧光蛋白融合基因的构建
目的构建P-选择素凝集素样结构域与红色荧光蛋白融合基因(pDsRed1-N1/L),以进一步明确P-选择素不同表位与功能间的关系,为阐明P-选择素生理病理意义奠定基础.方法应用PCR技术扩增质粒pCDM1/cDNA凝集素样区,用T4连接酶将其插入载体pDsRed1-N1;经酶切和测序对插入片段进行分析、鉴定.结果通过酶切和序列分析确定重,组 pDsRed1/N1的片段为目的基因的核苷酸序列.结论应用基因工程技术构建pDsRed1-N1/L 融合基因成功,为红色荧光蛋白作为生物标记分子来研究P-选择素分子的构效关系打下基础.
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AsRed2示踪前列腺癌肺转移模型的建立
目的:使用携带红色荧光蛋白(AsRed2)的前列腺癌PC-3细胞(PR7细胞)建立可用活体荧光成像技术监测的前列腺癌肺转移模型. 方法:分别采用MTT及Transwell实验比较前列腺癌PC-3与PR7细胞体外增殖、迁移及侵袭能力；将20只BALB/c裸鼠随机平均分为4组,分别尾静脉注射不同浓度PR7细胞悬液200μl,A 组:1×107/ml,B组:2.5×107/ml,C组:5×107/ml,D组:2.5×107/ml,并于1周后重复注射2.5 ×107/ml细胞悬液200μl.第2、4、6、8周分别用活体荧光成像技术检测各组肺转移灶形成情况. 结果:前列腺癌PC-3细胞与PR7细胞体外增殖、迁移、侵袭能力均无明显差异(P＞0.05)；第4周D组40％裸鼠用活体荧光成像检测到肺转移灶；第8周,A组20％、B组60％、C组100％、D组100％裸鼠可检测到肺转移灶；通过病理检查证实肺转移灶形成.结论:通过尾静脉注射携带红色荧光蛋白的前列腺癌PR7细胞可成功建立用活体荧光成像技术监测的前列腺癌肺转移模型.
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荧光蛋白在肿瘤的发生和发展方面的研究与应用
荧光示踪技术是激发光通过激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光，并利用生物荧光影像分析技术直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为。常用的是绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein ，GFP），随后发现的红色荧光蛋白（ red fluorescent protein ，RFP）在灵敏度和信噪比方面均比GFP高，此外还有黄色荧光蛋白（ yellow fluorescent protein，YFP）等，这为基于GFP的体内研究提供了一个很好的互补工具。随着荧光蛋白在细胞生物学上的广泛应用，使活体细胞显像问题得以解决，并且获得了空前的发展。尤其是荧光蛋白可以对各种细胞过程进行显像示踪，这些蛋白可作为报告基因，独特的荧光光谱能在体内外对尚未明确的细胞过程进行示踪。比如肿瘤发生发展过程中的各个阶段在细胞水平有何异常？荧光蛋白的活体成像能观察各种肿瘤模型中肿瘤细胞的生长和发展，包括肿瘤初的发生，肿瘤细胞随后的迁移和入侵，转移播种，生成血管以及肿瘤和宿主微环境间的相互作用等。荧光蛋白作为报告基因已被广泛应用于肿瘤各个阶段的研究中，本文就近些年来荧光示踪技术在肿瘤细胞发生和发展过程中的研究和应用作一综述。
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烟曲霉钙调蛋白的红色荧光蛋白标记及其在菌株极性生长的动态分布
目的 构建自身启动子调控、含有红色荧光蛋白(RFP)标记的钙调蛋白烟曲霉菌株,观察菌株生长过程中钙调蛋白的动态分布.方法 设计烟曲霉钙调蛋白基因的两端侧翼序列,对两序列及含有RFP-烟曲霉pyrG营养标记(mRFP-AfpyrG)的质粒分别进行PCR扩增,再通过融合PCR对上述3个片段进行整合,形成转化用的线性片段.随后采用原生质体转化法将上述片段转入烟曲霉受体菌株中,构建钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株.在营养筛选培养基平板上挑取单克隆菌落培养,选取荧光表型稳定的单菌菌落对其转化子进行PCR验证.将重组菌株和野生菌株分别接种于固体营养培养基中,培养不同时间后荧光显微镜下观察菌株形态学差异.将上述两株菌分别接种于液体培养基中,甲基四氮盐(xTT)方法观察其生长活力差异,并对红色荧光标记菌株进行动态活体观察,分析钙调蛋白在烟曲霉生长发育过程中的时空分布.结果 重组菌株的荧光表型及转化子的PCR鉴定结果表明,钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株构建成功.重组菌株与野生菌株在24 h时生长活力(A490值)分别为0.689±0.081和0.678±0.054(t=1.32,P＞ 0.05),差异无统计学意义,且形态学方面也无显著差异.钙调蛋白在烟曲霉生长过程中始终处于极性生长过程中的菌丝顶端、分枝出芽点及新形成的分枝顶端.结论 钙调蛋白可能参与调控烟曲霉孢子萌发及菌丝极性生长等重要生物学过程.
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RFP标记及bFGF/BMP-2信号诱导的牙组织工程的体内实验研究
目的 RFP标记的牙胚细胞和bFGF/BMP-2转染的骨髓间充质干细胞混合培养,复合3D打印聚乙烯醇(PVA)/双相陶瓷骨支架(DCCP)材料构建牙组织工程的体内孵育,探究其分化能力.方法 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;PVA/DCCP支架材料组;细胞团块+PVA/DCCP支架材料组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下.术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行免疫组化染色和激光共聚焦切片观察.结果 免疫组化:析因分析显示细胞团块+PVA/DCCP支架材料组在5、10 d DMP-1、BMP-4表达量高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义P<0.05;DSP在各组各时间点均为阴性表达,差异无统计学意义P>0.05.激光共聚焦显微镜显示:细胞团块+ PVA/DCCP支架材料组各时间点切片组织中都可观测到荧光标记的牙胚细胞.结论 RFP 标记的牙胚细胞和bFGF/BMP-2转染骨髓间充质干细胞混合培养,复合PVA/DCCP支架材料,构建牙组织工程成活并分化,其分化机制有待进一步研究.
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猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记
目的:建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive iPS细胞发育和分化的相关研究奠定基础.方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体TetO-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rtTA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)进行诱导,建立起猪iPS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定.在此基础上,向iPS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性.结果:所建立的iPS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like iPS细胞系.成功对所建立的iPS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的iPS细胞的多能性依然存在.结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like iPS细胞系.
关键词： 猪诱导性多能干细胞系 多能性 核转染 红色荧光蛋白 -
稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系.方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中.利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性.结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性.核转染前后hESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异.RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上.结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究.
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慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究
目的 探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导红色荧光蛋白(RFP)基因转染人脑胶质瘤干细胞可行性和试验方法.方法用无血清干细胞培养基培养人脑胶质瘤干细胞,然后用细胞免疫荧光染色检测其干细胞特性表面标志物CD133、Nestin表达情况.以HIV-1来源的慢病毒为载体,以RFP基因为目的 的基因转染人脑胶质瘤干细胞,荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况及其转染率.MTT法检测转染后细胞与未转染RFP细胞组细胞增殖情况.再次用细胞免疫荧光染色检测转染后脑胶质瘤干细胞表面标志物CD133、Nestin表达情况.结果 红色荧光慢病毒转染胶质瘤干细胞体外连续培养后,RFP在干细胞中稳定表达,在荧光显微镜下即发出红色荧光,并且转染效率高.RFP- lentivirus转染后干细胞与未转染RFP组比较,生长曲线无明显差异,且转染后干细胞表面标志物仍表达阳性.结论 采用HIV-1来源的慢病毒载体介导以RFP基因为生物标记物标记人脑胶质瘤干细胞是可行的,以慢病毒转染对干细胞的生长影响小,转染效率高.
