柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定

目的 探讨柯萨奇病毒B组3型(CVB3) woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白(EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201)真核表达载体,红色荧光蛋白(mCherry)与微管相关蛋白轻链3(LC3)的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹(Western blot)检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞(HeLa) LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.

一氧化氮供体和他汀对B组柯萨奇病毒感染的实验研究

目的 研究硝酸酯类和他汀类等一氧化氮(NO)供体的抗柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的作用及其特点和机制.方法 用TCID50和空斑形成实验测定CVB3的毒力;MTT法确定NO供体药物的无毒性浓度;利用细胞病变效应(CPE)抑制实验和空斑形成抑制实验分析NO供体药物对CVB3在HeLa细胞和ECV-304细胞中增殖的抑制作用;并分析硝酸甘油(GTN)不同给药次数、NO浓度变化以及NO浓度与GTN对CVB3抑制效应问的相关性.结果 硝酸酯类药物GTN、硝酸异山梨酯可明显抑制CVB3所致的CPE及空斑形成(P＜0.05),他汀类药辛伐他汀、洛伐他汀均未显示抑制CVB3所致的CPE(P＞0.05);CVB3接种前预先与GTN作用、CVB3接种同时加入GTN两种条件下CPE抑制率差异无统计学意义(P＞0.05);CVB3攻击后多次给予GTN的组间CPE抑制率差异无统计学意义(P＞0.05),但在CVB3攻击前不同时间点给予GTN的组间CPE抑制率差异有统计学意义(P＜0,05);NO浓度与不同时间点给予GTN的CPE抑制结果呈正相关(r=0.97,P＜0.01).结论 NO供体类药物硝酸酯类具有明确的抗CVB3感染作用,其抗CVB3增殖的作用与NO浓度呈正相关;他汀类药物在本实验条件下未观察到抗CVB3增殖作用,原因可能是细胞类型与他汀不匹配.

融合基因DNA疫苗STxB-VP1和MDC-VP1对CVB3的免疫效果研究

目的 构建融合基因DNA疫苗pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1,并免疫小鼠,观察其免疫效果.方法 从痢疾志贺菌PCR扩增志贺毒素B亚单位(STxB)基因片段,用RT-PcR法从小鼠脾细胞扩增巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)基因片段.将这两个基因片段分别与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的衣壳蛋白VP1通过一个编码15肽的柔性接头(Linker)相连接,构建真核表达质粒peDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/MDC-VP1.120只BAI B/c小鼠随机均分为6组,分别在胫骨前肌注射pcDNA3、pcD-NA3/STxB、pcDNA3/MDC、pcDNA3/VP1、pcDNA3/STxB-VP1和peDNA3/MDC-VP1,每3周1次,共3次.每次免疫后20d检测血清中中和抗体水平,后1次免疫后20d用7LD50的CVB3进行致死性攻击,观察小鼠生存率.结果 成功构建了融合基因疫苗pcD-NA3/STxB-VP1和peDNAa/MDC-VP1.各组小鼠的生存率分别是10%、10%、15%、40%、20%和75%,中和抗体水平及血中病毒滴度均与生存率一致.结论 与pcDNA3/VP1相比,pcDNA3/MDC-VP1可诱导产生高水平的中和抗体,提高小鼠生存率,而peDNA3/STxB-VP1仅诱导出低水平的中和抗体,小鼠的生存率降低.

IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响

目的:观察IL-2、IFN-γ和GM-CSF重组质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果.方法:将50只4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3 组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/m IFN-γ组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组,每组10只.均每3周接种1次,共3次.每次接种的第20 d内眦静脉采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价.第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果:各组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P＜0.05);第3次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度、脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均高于其他组(P＜0.05 ).结论:三种细胞因子基因佐剂均能增强pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,GM-CSF基因佐剂的免疫效果优于IL-2和IFN-γ.

表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性.用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达.收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力.将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析.结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVB VP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位.本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定.随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株.因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定.

菘蓝的4种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究

目的:了解菘蓝4种有效单体(6,7,8,9号)抗柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的活性.方法: 通过观察细胞病变效应(CPE),噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,用半定量RT-PCR检测不同药物浓度下病毒核酸含量,以确定有效单体抗CVB3的作用.结果:菘蓝的4种单体成分对CVB3生物合成均有抑制作用,且强于阳性对照药物病毒唑.表现在随着药物浓度的增加,CPE程度逐渐减弱,病毒核酸的含量逐渐下降.结论:菘蓝的4种单体能在体外通过抑制生物合成发挥抗CVB3作用.

MDC、STxB与CVB3 VP1融合DNA疫苗的免疫效果比较

目的 比较小鼠巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)和志贺毒素B亚单位(Shiga tox-in B subunit,STxB)与柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合DNA疫苗的免疫效果.方法 将120只雄性BALB/c小鼠分为6组,每组20只,分别肌内注射peDNA3、pcDNA3/MDC、pcDNA3/STxB、pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-VP1和pcDNA3/STxB-VP1,每3周1次,共3次,每次免疫后20 d取血清,用微量中和试验检测CVB3中和抗体,第3次免疫后3周,每组取3只小鼠,取脾脏制备脾细胞,用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性,其余小鼠用IOLD50的CVB3攻击,观察小鼠的生存情况.结果 pcDNA3/VP1、pcDNA3/STxB-VP1和peDNA3/MDC.VPl组均能诱导小鼠产生中和抗体;除peDNA3/STxB-VP1组外,另两组抗体滴度随免疫次数增加而提高;第3次免疫后,pcDNA3/MDC-VP1组平均抗体滴度和脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性高于pcDNA3/VP1(P<0.05).病毒攻击后,pcDNA3/MDC-VP1组21 d生存率高于其他各组(P<0.05).pcDNA3/STxB-VP1组抗体滴度和生存情况与peDNA3/VP1组无明显差异.结论 融合基因疫苗pcDNA3/MDC-VP1能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫,提高了小鼠生存率,免疫效果优于pcDNA3/STxB-VP1.

免疫途径和佐剂对CVB3VP1蛋白免疫效果的影响

目的:观察不同免疫途径和佐剂类型对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)衣壳蛋白VP1免疫效果的影响.方法:将原核表达质粒pET-his/VP1转入E.coli BL21 (DE3) pLysS中,用异丙基-1-硫代-β呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导CVB3VP1蛋白的表达并进行纯化.首先采用不同的免疫途径(皮下,腹腔,肌肉)用VP1蛋白免疫小鼠,每组12只.然后另取小鼠分为PBS组和不同佐剂组(氢氧化铝、弗氏佐剂、Montanide ISA720),每组18只,采用肌肉注射途径免疫.每次每只小鼠注射50μg,共免疫3次,间隔3周.用ELISA和微量中和试验检测血清特异性IgG抗体和中和抗体.用CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性.用致死量的CVB3攻击后,检测血中病毒的滴度并观察小鼠的存活状况.结果:在大肠杆菌中成功表达CVB3VP1蛋白.三种免疫途径比较,肌肉注射组血清中和抗体和特异性IgG抗体的水平明显高于其他组(P＜0.01).采用肌肉注射免疫时,弗氏佐剂组Montanide ISA 720佐剂组的体液免疫和细胞免疫应答的水平明显高于氢氧化铝组(P＜0.05)；但血中病毒的滴度低于氢氧化铝组(P＜0.05).弗氏佐剂组小鼠的生存率好于氢氧化铝组(P＜0.05).结论:采用肌肉注射途径,并联合弗氏佐剂或Montanide ISA 720佐剂可以使CVB3VP1免疫获得较好的免疫效果.

IL-2和GM-CSF表达质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗作用的比较

目的:比较IL-2与GM-CSF两种细胞因子对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果.方法:4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/hIL-2混合注射组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mGM-CSF混合注射组,每组10只.每3周接种1次,共3次.每次接种后的第20天眼眶采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价.第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果:pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度明显提高,小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均有增强.结论:GM-CSF作为本疫苗分子佐剂能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫,免疫效果优于IL-2.

柯萨奇病毒B组3型和肠道病毒71型入胞机制比较研究

目的 比较柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CV-B3)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV A71)的入胞机制.方法 分别用CV-B3和EV-A71感染经不同小分子入胞抑制剂处理后的HeLa细胞,通过细胞免疫染色及图像分析,量化比较感染结果.结果 细胞松弛素D、长春碱、巴弗洛霉素A1及布雷菲德菌素A均能抑制CV-B3和EV-A71对HeLa细胞的早期感染,表明两种病毒的入胞过程均需要细胞骨架、内吞小体酸化及膜泡运输作用;肝素能抑制EV-A71的感染并呈浓度依赖关系,但对CV-B3无显著作用,表明细胞膜表面的硫酸乙酰肝素参与EV-A71但可能不参与CV-B3的入胞过程;巴弗洛霉素A1对EV-A71的抑制更明显,说明在病毒脱衣壳过程中,EV-A71较CV-B3依赖更低的pH;细胞骨架抑制剂处理结果表明CV-B3的入胞过程更依赖于微管蛋白而非微丝蛋白的作用.结论 CV-B3和EV-A71具有相似的入胞机制,但却各具特点,为研究两者的抗病毒药物提供了依据.

柯萨奇病毒B组3型的分子流行特征分析

目的 探讨已公布的不同国家不同时间分离的人类柯萨奇病毒B组3型(human coxsackievirus B3,CB3) VP1区基因特征和分子流行特点.方法 在GenBank中用BLASTN软件搜索不同国家/地区、不同时间发表的CB3 VP1区基因序列,共得到来自8个国家的92个可用序列,用MEGA软件计算不同毒株的核苷酸和氨基酸差异率,并构建系统进化树.结果 92株病毒可分为5个基因型(Genotype 1～5),基因型1由CB3原型株Nancy和3个法国株组成,基因型2由4株美国株组成,基因型3的地理分布广,由德国、美国、罗马尼亚、法国、日本、荷兰、瑞典分离株组成,基因型4由5株中国台湾分离株组成,基因型5由中国山东株、云南株和台湾株组成,该基因型又分为A～E 5个亚型.不同毒株的核苷酸差异率为6.90％～24.64％(氨基酸差异率1.00％～10.20％),不同基因型之间的核苷酸差异率为15.91％～24.64％(氨基酸差异率4.02％～10.20％).结论 不同基因型/亚型可以在同一个地区流行很长时间,同一时间内不同的基因型/亚型又可在不同的地区流行,具有明显的时间和地域流行特点.

柯萨奇病毒B组3型疫苗研究进展