首页 > 文献资料
-
肠道病毒71型衣壳蛋白VP1特异性识别和激活手足口病患儿CD4+T细胞免疫活化
目的 探讨肠道病毒病毒71型衣壳蛋白VP1诱导EV71感染患儿外周血T淋巴细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)应答特征.方法 收集2010年9月至2011年12月西安交通大学医学院第二附属医院和西安市儿童医院住院的EV71感染手足口病患儿共31例,根据临床特征分为3组:急性感染期组(16例)、临床恢复期组(9例)和感染恢复后1个月组(6例);另外,选取10例健康儿童为对照组.通过重叠肽技术合成覆盖EV71衣壳蛋白VP136条重叠肽段作为抗原,采用IFN-γ酶联免疫斑点分析法(ELISPOT)和磁珠分选法(MACs)体外检测各组患儿EV71 VP1特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答特征.结果 急性感染期组有4例(25％)患儿对VP1蛋白存在T细胞免疫反应,临床恢复期组5例(56％)患儿对VP1蛋白存在T细胞免疫反应,其中EV71感染临床恢复期组患者反应强度强,显著高于急性感染期,差异有统计学意义(Z=-2.042、P=0.041),而感染恢复后1个月组和对照组均未检测到T细胞免疫反应,临床恢复期组患者T细胞反应强度显著高于感染恢复后1个月组(Z=-2.105、P=0.035)和对照组(Z=-2.633、P=0.008),差异均有统计学意义;提示EV71感染患儿VP1蛋白被识别的频率(即例数)随着临床症状及体征消失而消失.VP1蛋白诱导的细胞免疫应答以特异性CD4+T细胞为主导;筛选确定了8个EV71 VP1蛋白区CD4+T细胞表位.结论 EV71感染患儿在发病期对VP1蛋白存在特异性T细胞反应,且以特异性CD4+T细胞为主导;筛选确定EV71感染患儿VP1蛋白的CD4+T细胞表位有助于阐明EV71感染的细胞免疫学发病机制.
-
JC病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化
目的 构建JC病毒衣壳蛋白VP1基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化该蛋白. 方法用PCR方法扩增患者尿液中JC病毒衣壳蛋白VP1的基因,测序正确后将其克隆入pET-32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达VP1融合蛋白.大量表达该融合蛋白并用镍柱亲和层析法纯化. 结果成功构建重组表达载体,30℃,IPTG诱导可见有融合蛋白表达,存在形式为包涵体.该融合蛋白相对分子质量约为59kDa.Western blot证明融合蛋白具有很好的抗原性.用镍柱亲和层析法成功纯化出VP1融合蛋白.结论 成功表达VP1融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
-
柯萨奇病毒A组6型衣壳蛋白VP1的原核表达及其抗血清的制备
目的 原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清.方法 合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,同时优化IPTG终浓度(0.1、0.2、0.3、0.5 mmol/L)、诱导温度(15、20、25、30℃)及诱导时间(6、8、12、16 h).表达产物采用Ni-NTA柱亲和层析纯化,将纯化重组蛋白免疫新西兰兔,制备VP1抗血清,微量细胞病变法检测血清抗体效价.结果 重组质粒pET-28a-VP1经双酶切及测序鉴定,构建正确.重组蛋白适诱导条件为:IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为12h.重组蛋白相对分子质量约34 000,于上清和包涵体中均有表达,纯化后纯度可达95％以上.兔血清效价均＞1∶8,呈阳性.结论 成功于原核表达系统中高效表达了可溶性CVA6-VP1蛋白,且获得效价较高的抗血清.
-
EV71VP1黏膜疫苗制备及其诱导黏膜免疫的实验研究
目的 研究表面展示肠道病毒71型(EV71)结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢制备疫苗的可行性及应用价值.方法 以表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌及野生型同基因株枯草芽孢杆菌制备疫苗,并分别通过灌胃+滴鼻途径免疫BALB/c小鼠(观察组和对照组各16只),4周后摘眼球取血,脱臼处死小鼠收集肺泡及小肠冲洗液,采用ELISA方法检测血清、肺黏膜、肠黏膜中VP1特异性IgA抗体水平.结果 枯草芽孢杆菌经培养及溶菌酶处理后均以芽孢形式存在；观察组血清及肺黏膜中VP1特异性IgA抗体水平均显著高于对照组(P均＜0.01),但两组肠黏膜中抗体水平无显著差异.结论 展示EV71结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢可成功制备疫苗,且能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应；此为EV71疫苗的研制提供了新思路.
-
肠道病毒71型衣壳蛋白VP1研究进展
人肠道病毒71型(enterovims 71,EV71)是婴幼儿手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要致病原之一.临床研究发现,EV71感染可导致多种临床表现,从轻微HFMD到致命性脑干脑炎并发肺水肿甚至死亡,但原因尚不清楚.EV71衣壳蛋白VP1在病毒识别、结合、进入靶细胞及病毒颗粒装配过程中发挥核心作用,VP1变异是EV71适应性和免疫原性的重要决定因素.现对VP1结构、功能及其相关的抗病毒疫苗和药物的研究进展进行综述,为进一步研发新的更有效的抗病毒疫苗和药物提供理论基础.
-
东莞市2014年手足口病病原检测与基因特征分析
目的 对东莞市2014年手足口病(HFMD)疑似病例样本进行病原学检测,并对引起HFMD的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)进行基因特征分析,为东莞市HFMD的防控提供基础资料.方法 采用Real time RT-PCR(实时荧光PCR)方法对HFMD疑似病例样本进行检测,核酸阳性样本上送广东省疾病预防控制中心,进行病毒分离及鉴定,基因扩增并测定VP1基因序列.从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用DNA-STAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4.0.2软件构建亲缘性进化树.结果 共检测HFMD疑似病例样本693份,核酸阳性结果614份,总阳性率为88.60％.其中EV71阳性结果241份,占39.25％,CA16阳性194份,占31.60％,其他肠道病毒(EV)179份,占29.15％.共获得11株EV71分离株和8株CA16分离株的VP1基因全长序列.11株EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.3％～100.0％和98.3％～100.0％,8株CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9％～100.0％和99.3％～100.0％.系统进化树分析显示,1 1株EV71全部属于C4a基因亚型;8株CA16分离株中有6株属于B1b基因亚型,2株属于B1a基因亚型.结论 2014年引起东莞市HFMD的EV71型病毒流行株为C4a基因亚型,CA16型病毒流行株B1a和B1b亚型并存,并兼有一定比例的其他肠道病毒.
-
免疫途径和佐剂对CVB3VP1蛋白免疫效果的影响
目的:观察不同免疫途径和佐剂类型对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)衣壳蛋白VP1免疫效果的影响.方法:将原核表达质粒pET-his/VP1转入E.coli BL21 (DE3) pLysS中,用异丙基-1-硫代-β呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导CVB3VP1蛋白的表达并进行纯化.首先采用不同的免疫途径(皮下,腹腔,肌肉)用VP1蛋白免疫小鼠,每组12只.然后另取小鼠分为PBS组和不同佐剂组(氢氧化铝、弗氏佐剂、Montanide ISA720),每组18只,采用肌肉注射途径免疫.每次每只小鼠注射50μg,共免疫3次,间隔3周.用ELISA和微量中和试验检测血清特异性IgG抗体和中和抗体.用CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性.用致死量的CVB3攻击后,检测血中病毒的滴度并观察小鼠的存活状况.结果:在大肠杆菌中成功表达CVB3VP1蛋白.三种免疫途径比较,肌肉注射组血清中和抗体和特异性IgG抗体的水平明显高于其他组(P＜0.01).采用肌肉注射免疫时,弗氏佐剂组Montanide ISA 720佐剂组的体液免疫和细胞免疫应答的水平明显高于氢氧化铝组(P＜0.05)；但血中病毒的滴度低于氢氧化铝组(P＜0.05).弗氏佐剂组小鼠的生存率好于氢氧化铝组(P＜0.05).结论:采用肌肉注射途径,并联合弗氏佐剂或Montanide ISA 720佐剂可以使CVB3VP1免疫获得较好的免疫效果.
-
小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1单克隆抗体的制备
目的 制备肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1特异性小鼠单克隆抗体(mAb)并检测其特异性.方法 合成编码EV71-VP1的基因并克隆入原核表达质粒pET21a;采用重组表达的VP1免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合并采用ELISA筛选可分泌抗VP1的mAb的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化mAb,并采用SDS-PAGE和Western blot法检测mAb的纯度和特异性;EV71感染Vero细胞,采用间接免疫荧光细胞化学染色和Western blot法评估所制备mAb识别EV71的能力.结果 成功表达了EV71-VP1,制备出了4株杂交瘤细胞(6E、8D、9F和10C),杂交瘤细胞所分泌的小鼠mAb均可识别EV71.结论 成功制备了小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1的mAb.
