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小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究
目的探讨小鼠原始生殖细胞(PGC)的体外增殖与分化.方法将PGC与睾丸支持细胞(SC)共培养进行PGC的体外增殖.用原代PGC悬浮培养获取类胚体(EB),将EB贴壁培养,观察自然分化的结果.结果PGC与SC共培养可获得大量PGC集落.组织化学与免疫组织化学法显示,PGC集落碱性磷酸酶(AKP)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)均呈阳性表达.将PGC悬浮培养可获得EB,EB贴壁生长后,可自然分化形成上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.结论小鼠PGC与SC共培养能在体外大量增殖.并保持干细胞特性.PGC可形成EB,EB自然分化后大多数形成神经样细胞、其次是上皮样细胞和成纤维样细胞.
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维甲酸诱导和生精小管重构促使小鼠诱导多能干细胞向雄性生殖细胞分化的实验研究
目的 探讨体外维甲酸联合异位重构生精小管诱导小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向雄性生殖细胞分化的潜能. 方法 自2010年12月至2011年12月,采用悬浮法培养小鼠iPSCs形成类胚体.类胚体培养至第5天,添加维甲酸进行诱导,不添加维甲酸的类胚体自发分化组作为对照组.收集培养10d的类胚体,采用实时定量PCR和免疫细胞化学检测其生精细胞相关基因和蛋白的表达.同时将类胚体消化为单细胞,与新生小鼠睾丸细胞混合注入雄性裸鼠皮下,移植完成后裸鼠行手术去势,移植后第4、6、8、12周取移植物进行HE染色和免疫组织化学染色. 结果 小鼠iPSCs经类胚体形成及维甲酸诱导后Stra8、Odf2、Act和Prm1基因的相对表达量上调,分别为对照组的(4.50±1.02)、(1.48±0.04)、(10.52±0.25)和(323.28±25.64)倍;Oct-4、Dppa3、Piwil2、Tex14和Scp3基因相对表达量下调,分别为对照组的0.56±0.02、0.11±0.01、0.50±0.01、0.53±0.14和0.16±0.00.类胚体同时表达雄性生殖细胞相关蛋白VASA和联合复合体蛋白3.HE染色发现,iPSCs来源生精细胞和新生小鼠的睾丸细胞共移植后能重构成类生精小管.免疫荧光染色结果显示,类生精小管管腔内可见由iPSCs分化而来的VASA阳性生精细胞. 结论 小鼠iPSCs经类胚体形成和维甲酸诱导后可分化为雄性生殖细胞.部分iPSCs来源的生精细胞可定居于类睾丸生精小管的基底膜,异位重构的生精小管可为iPSCs向雄性生殖细胞分化提供适宜的微环境.
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人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体
目的:研究人类胚胎干细胞的体外多向分化能力.方法:胚胎干细胞在无饲养细胞、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、悬浮条件下培养形成类胚体.采用RT-PCR方法检测不同培养时间类胚体中某些功能细胞的特征分子标志.结果:在无饲养细胞、无bFGF、悬浮条件下培养,胚胎干细胞自动聚集形成细胞团,逐渐长大并分化为囊实性类胚体.RT-PCR显示,类胚体表达多种细胞前体及功能细胞的分子标志,如神经前体细胞、胰岛前体细胞以及成熟神经细胞、表达胰岛素的β细胞、表达胰高血糖素的α细胞和肝细胞等等.不同细胞标志在类胚体中出现的时间段有差异,先出现分化程度低的前体细胞分子标志,然后出现成熟细胞的分子标志.结论:人类胚胎干细胞体外可自然分化为表达多种细胞标志的类胚体,是进行深入体外诱导分化研究的基础.
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原始生殖细胞体外增殖与分化的研究
目的 探讨小鼠原始生注细胞(primordial germ cells,PGCs)体外增技及分化的条件.方法 使用PGCs与睾丸支持细胞(SCs)共培养的方法进行PGCs体外增殖培养.用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体(Ebs),将Ebs进行贴壁培养,观察其自然分化的过程.结果 将PGCs与SCs共培养可获得大量PGCs集落,形似鸟巢状,组织化学与免疫组织化学染色显示提取的PGCs和增殖培养的PGCs集落的碱性磷酸酶(AKP)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-l)均呈阳性表达.使用悬浮培养的方法可获得Ebs,将EBs贴壁培养后,可分化为上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.结论 小鼠PGCs与SCs共培养能在体外大量增殖,并保持其干细胞特性.悬浮培养可使PGCs形成Ebs,将EBs贴壁培养可分化形成内、中和外三个胚层的细胞,即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.
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建立仿人类胚胎早期血管发生的芽生类胚体模型
目的 以分化后人胚胎干细胞为材料,建立仿人类早期胚胎血管发生的芽生类胚体模型.方法 将未分化人胚胎干细胞以类胚体(EB)的形式诱导分化,再以不同的血管生成刺激因子作用于类胚体、进行芽生类胚体的二次诱导,摸索芽生类胚体的佳培养条件;并以LDL吞噬法、免疫荧光抗体标记以及培养体系中加入血管生成抑制因子等方法检测芽生类胚体中是否存在人胚胎干细胞分化后的早期血管内皮细胞.结果 (1)分化第11天的类胚体已能够在胶原基质中形成芽状分支,彼此间还能互相连接形成网络状结构.(2)在含有血管内皮生长因子(VEGF)、酸性成纤维细胞生成因子(FGF)的胶原基质中,从EB中伸展出的芽状分支能吞噬Dil-AcLDL、表达CD31、具有类似于血管腔的三维中空结构,称为芽生EB.刺激芽生EB发生的细胞因子佳浓度为:VEGF50ng/ml,FGF 100 ng/nd.(3)芽生EB间的网络状结构,能被血管生成抑制因子内皮抑素和PF4抑制.结论 芽状结构中含有由人胚胎干细胞分化而来的内皮细胞,芽生EB是研究人类胚胎发育过程中早期胚胎血管生成的一种模型.
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胚胎干细胞和成体干细胞的鉴定
胚胎干细胞是一种具有在体外不分化的无限增殖能力，而在一定条件下又能分化为体内多种细胞类型的原始细胞。自1998年美国Thomson等建立人胚胎干细胞系以来，对人胚胎干细胞的建系及开发利用引起了国内外的高度重视。而人胚胎干细胞系的建立以及定向分化的成功与否必须通过鉴定来确定。现就胚胎干细胞和成体干细胞的鉴定如下综述。
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类胚体中残留胚胎干细胞数量与其致瘤性相关性的初步研究
目的 探讨类胚体(EBs)中残留未分化胚胎干细胞(ESCs)的数量与其致瘤性的相关性.方法 小鼠R1胚胎干细胞株,体外类胚体诱导分化10d,流式细胞仪检测残留未分化ESCs表面标志SSEA-1阳性率.将第10天EBs消化打散后重新给予ESCs常规培养体系培养,观察EBs中残留未分化ESCs形态,流式细胞仪检测残留细胞表面标志物;第10天EBs消化打散后以104～2×106细胞量分别注射至裸鼠四肢肌肉内,观察不同细胞数量与畸胎瘤形成的相关性.结果 ESCs分化为EBs 10 d后有(13.5±0.75)%的细胞表达SSEA-1,提示存在残留未分化ESCs.残留未分化细胞生长形态呈克隆样,高表达SSEA-1等未分化ESCs标志.EBs消化打散后仅在注射2×l06个细胞的部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织,其余各组均未见畸胎瘤的形成.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化胚胎干细胞,并需要一定细胞数量才具有致瘤性.
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诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立
背景：目前，大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立，但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。
目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。
方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞，获得了诱导多能性干细胞；在诱导分化体系中添加了 Y-27632，克服干细胞扩增中的凋亡现象；运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。
结果与结论：①前3代细胞克隆传代时，诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多，很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂，能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下，经过体外诱导分化，形成CD34+造血祖细胞。 -
Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化
背景:Y-27632是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶抑制剂,已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用.另外,其对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用.而如何提高胚胎干细胞向类神经元细胞分化是神经损伤修复和神经再生领域热点问题.目的:探讨Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞分化效率的作用.方法:取16代人胚胎干细胞复苏后,进行形态观察和染色鉴定,采用悬浮培养法制备类胚体,培养8 d后,进行分组贴壁培养:对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化;Y-27632组分别在Sato培养基加入5,10, 20,40 μmol/L Y-27632.培养10 d后进行染色鉴定;10-18 d后,进行免疫荧光染色检测胚胎干细胞分化效率和类神经元细胞突起生长情况.结果与结论:①人胚胎干细胞共表达Oct4和SSEA-3干细胞特异蛋白;②悬浮分化培养8 d后,进一步贴壁培养10 d,可观察到具有神经形态,且表达Tuj-1的类神经元细胞;③经不同浓度的Y-27632诱导后,免疫荧光染色发现贴壁细胞数和Tuj-1阳性细胞数显著增加,提示胚胎干细胞向类神经元细胞分化速率加快,且在浓度为10 μmol/L时为明显;④分化培养18 d后,免疫荧光染色显示,与对照组相比,10 μmol/L Y-27632组的Tuj-1阳性细胞数及突起数和突起长度显著增加;⑤结果说明,Y-27632不仅能够促进人胚胎干细胞向类神经元细胞分化,同时促进类神经元细胞突起的生长.
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类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究
目的 探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞(ESC)的特性.方法 小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20 d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养.观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力.将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查.结果 分化20 d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留.残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留.
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胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长
目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞.采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究.
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稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系.方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中.利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性.结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性.核转染前后hESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异.RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上.结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究.
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体外制备原始生殖细胞来源类胚体的一种方法
目的 探讨一种利用鸡原始生殖细胞作为种子细胞,体外制备类胚体的方法.方法 采用干细胞体外培养获得干细胞系并制备类胚体,采用免疫荧光染色、HE染色、RT-PCR及诱导分化等技术对干细胞系及类胚体的生物学特性进行鉴定分析.结果 通过悬浮培养获得了大体积为440 μm的类胚体,并借助共聚焦显微镜活体细胞成像系统捕捉到其向心肌分化后自主收缩的影像.结论 本研究提供了一种快速、高效的体外制备大体积类胚体的技术方法.
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诱导的多潜能干细胞类胚体分化过程中残留未分化细胞的研究
目的:探讨诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)通过类胚体长期分化后残留未分化细胞的特性.方法:小鼠iPS细胞株,体外类胚体分化20天后消化打散,重新给予iPS细胞常规培养液培养.观察扩增的残留细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力.将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查.结果:分化20天的类胚体中存在残留未分化的细胞,呈克隆样生长,高度表达SSEA-1、CD-9和0CT-4等多潜能性标志.残留细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留.残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织.结论;iPS细胞分化为类胚体后残留部分未分化细胞,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留.
