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041 多能干细胞--发育毒性研究的新思路
近年来多能干细胞引起了许多科学家的关注,在临床中已被作为一种基因治疗和细胞治疗手段广泛应用于多种难治之症的研究,如帕金森病、老年性痴呆、肿瘤以及器官移植等.同时,多能干细胞作为一种原始细胞具有旺盛的增殖、自我稳定能力和多向分化的潜能,因此,还可以作为一种新的测试细胞应用于环境因素致发育毒性的检测和机制研究.它的应用无疑为生殖发育毒理研究打开了一扇崭新的大门.
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原始卵泡的形成与发育
在胚胎发育时期,原始生殖细胞形成并迁移至生殖腺,形成种系囊.卵原细胞进入减数分裂成为卵母细胞.随后种系囊分裂,单个卵母细胞与前颗粒细胞组装成原始卵泡.前泡膜细胞被募集到原始卵泡周围,原始卵泡发育并向初级卵泡转化.原始卵泡的形成和发育是卵巢生物学的重要过程,阐释其分子和细胞机制为调节卵巢功能和治疗卵巢疾病提供方向.
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信号通路抑制剂和饲养层对猪胚胎生殖细胞建系的影响
胚胎生殖细胞(EGCs)是原始生殖细胞(PGCs)在体外特定条件下,经重编程而形成的、具有和胚胎干细胞(ESCs)相似特性的多能性干细胞.猪EGCs的研究在利用EGCs进行核移植、生产转基因动物以及建立生物反应器方面具有广阔的应用前景.然而到目前为止真正意义上的猪EG细胞系还没有建立,体外培养条件不确定是影响猪EGCs建系的重要因素之一.本研究探讨了猪PGCs体外培养过程中不同信号通路抑制剂以及不同饲养层对其重编程形成EGCs的影响,确定了CHIR99021、SB431542和小鼠成纤维细胞制作的饲养层组合,能够较大程度维持PGCs的增殖及存活能力,实现向EGCs的重编程.
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全能干细胞分化的研究进展
对于全能干细胞的分化研究目前已成为当今医学界研究的热点,但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题,近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展.本文重点将这三种全能干细胞从其分化机制、定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述.
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人胚胎干细胞研究的现状与前景
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与早期囊胚ICM或PGCs相似的生物学特性,在体外能够保持正常二倍体核型和未分化状态,并且有多方向分化潜能.在适当条件下,ES细胞可被诱导分化为多种细胞、组织,也可以与受体胚胎嵌合,形成嵌合体.1998年,美国威斯康星大学Thomson等[1]率先成功分离、克隆了人胚胎干细胞,并建立了细胞系,这一研究成果立刻在国际上引起轰动,成为世界关注的焦点.由于人ES细胞具有其它哺乳动物ES细胞的一般特性,能够在适宜条件下分化成构成人体的任何一种组织.因此,人ES细胞能够为组织工程研究提供可靠的细胞来源,同时能够在人早期胚胎发生、细胞组织分化以及基因调控等研究领域发挥重要作用.基于此,笔者针对人胚胎干细胞的研究进展及其应用前景做一简要回顾[1-10].
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小鼠囊胚内细胞团的生长行为
胚胎干细胞[1](ES细胞)是由着床前内细胞团(ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养而建立的克隆细胞系.能够广泛的分化成各种组织细胞,具有潜在的科研及应用价值.
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诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞样细胞分化的新方法
目的 探索诱导小鼠原始牛殖细胞向肝细胞样细胞定向分化的有效方法 .方法 分离孕13 d昆明小鼠的原始生殖细胞(PGC),体外培养扩增后,向其培养液中加入新生鼠肝组织提取液和包被有胎肝细胞的微囊共培养,利用微环境诱导法使PGC定向分化,然后免疫细胞化学法标记α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和白蛋白(ALB).结果 在微环境的诱导作用下,可见PGC分化成卵圆形或星形肝细胞样细胞,并且分化细胞的数量随诱导时间延长而增多,培养2周时分化率可达70%以上.分化的肝细胞样细胞中,AAT和ALB均呈阳性表达.结论 应用新生小鼠肝组织提取液和包被有胎肝细胞的微囊构成的微环境,可有效诱导PGC向肝细胞方向分化.
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定向诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞分化的研究
目的探索诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞定向分化的佳条件.方法分离提取小鼠的原始生殖细胞,体外培养扩增后,接种到6孔培养板中.向不同孔中分别加入不同浓度的bFGF、EGF、β-NGF、RA、肝细胞提取液和与胎肝组织分隔培养,进行诱导分化.用靛青绿摄入试验和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、白蛋白(ALB)免疫细胞化学染色鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的状况.结果与胎肝组织分隔培养2 d,可见原始生殖细胞向肝样细胞分化,分化细胞呈圆形和星形,圆形细胞多呈簇状,可以摄入靛青绿呈绿色,并呈AAT和ALB免疫阳性着色,培养12 d时分化率达80%.肝细胞提取液也可诱导原始生殖细胞向肝样细胞分化,12 d时分化率达70%以上;0.5g/L和1 g/L的肝细胞提取液的诱导分化率无显著差异;但是0.5 g/L提取液诱导组圆形细胞较多;而1 g/L肝提取液诱导组,星状分化细胞多.β-神经生长因子(β-NGF)诱导4 d,可见肝样细胞出现,随诱导时间延长,分化细胞增多,圆形分化细胞较多,12 d时分化率达60%以上;20 μg/L和50 μg/L两种浓度的β-NGF诱导分化率无显著差异.bFGF、EGF、RA诱导组未见ALB免疫反应阳性细胞.RA可以增强β-NGF的诱导分化作用,使星状细胞增多明显.结论β-NGF和肝细胞因子可诱导原始生殖细胞向肝细胞定向分化.
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人胚胎干细胞表达生殖细胞分化相关基因的研究
目的 探讨人胚胎干细胞(hES)系H1生殖细胞分化相关基因的表达.方法 免疫荧光、碱性磷酸酶检测和核型分析等方法联合鉴定H1的基本生物学特性,RT-PCR方法检测未分化H1的生殖细胞分化相关基因的基本表达模式,分别以人正常睾丸组织和人胚胎成纤维细胞株HFF-1作为阳性和阴性对照组织.结果 H1保持正常核型并维持未分化状态.未分化H1表达减数分裂前生殖细胞标志基因STELLAR、DAZL、FRAGILIS、PUM1、PUM2和GDF3;不表达原始生殖细胞(PGCs)标志基因BLIMP-1、减数分裂特异标志基因SCP1、减数分裂启动标志基因STRA8以及生殖细胞分化后期标志基因VASA.结论 未分化Hl细胞表达生殖细胞减数分裂前标志基因,但不表达分化后期基因,BLIMP-1可能成为区分未分化hES细胞与PGCs的特异性标志基因.
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鸡胚原始生殖细胞定向诱导分化为脂肪和神经元样细胞
目的 探索培养传代后鸡胚原始生殖细胞(EPGCs)的多向分化潜能,比较不同诱导程序、不同特异性化学诱导剂及其协同作用.方法 分别获取发育至19期和28期的鸡胚PGCs,体外培养传代到第4代.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1.甲基黄嘌呤(IBMx)诱导EPGCs向脂肪细胞分化.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂维甲酸(RA)、丁化羟基苯甲醚(BHA)、IBMx、二甲基亚砜(DMSO)诱导EPGCs向神经元样细胞分化.结果 1.EPGCs被诱导7～21d后,分化成脂肪细胞,其中诱导程序(2)(见正文中叙述)的诱导分化效果较好,第19、28期分化率分别为89%和91%.诱导剂联合协同作用的诱导效果极显著地(P＜0.01)高于单独作用的诱导效果.诱导的脂肪细胞经特异性的油红O和苏丹红染色为阳性,并检测到特异性过氧化物酶体增生物激活受体?(PPAR-?)的表达.2.EPGCs被诱导3～7d后,分化成神经元样细胞.RA、IBMx单独使用对神经元样细胞的形成率分别为82%和83%,极显著地(P＜0.01)高于RA、BHA、DMSO和IBMX的协同作用的效果.诱导的神经元样细胞特异性免疫组织化学检测显示,均有神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白M(NFM)的表达,而无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结论 鸡EPGCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞.
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转录因子Nanog在小鼠原始生殖细胞的时空表达
目的 讨Nanog在小鼠原始生殖细胞发育过程中的时空表达.方法 采用免疫荧光技术定性研究Nanog在妊娠7.5～15.5d胚胎原始生殖细胞的表达;抗SSEA-1、抗Nanog双标记激光共焦扫描进一步定量分析妊娠11.5～15.5d小鼠原始生殖细胞中Nanog的表达变化. 结果尿囊、后肠及背肠系膜、生殖嵴的原始生殖细胞中均可见Nanog的阳性表达.妊娠11.5d小鼠原始生殖细胞中Nanog的表达阳性率高、荧光强度强,雌性小鼠在妊娠12.5d后Nanog表达急剧下降,雄性小鼠在妊娠13.5d后Nanog表达急剧下降. 结论 Nanog在增殖的小鼠原始生殖细胞中稳定表达,其表达下调可能与原始生殖细胞的分化启动有关.
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鸡胚胎原始生殖细胞对不同冷冻体系适合性的研究
目的研究鸡胚胎原始生殖细胞(EPGCs)对不同冷冻体系的适合性. 方法对发育至第19期和第28期胚胎性腺PGCs,采用二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、聚乙二醇为冷冻保护液,在不同组合、不同浓度、不同的冷冻程序下进行超低温冷冻保存.结果1.采用同一种冷冻保护液,10%浓度与15%浓度之间,除DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)外,其他类型的冷冻液对EPGCs保存后存活率的影响差异不显著(P＞0.05);20%浓度的各种冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率低,且与10%和15%浓度相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);2.采用同一种冷冻保护液,浓度为10%时,冷冻程序Ⅰ(2～4℃平衡45～60min,-4～-6℃诱发结晶45min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存)和冷冻程序Ⅱ(2～4℃平衡90～120 min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存)对EPGCs冷冻后存活率差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);3.采用冷冻程序Ⅰ,浓度为10%时,不同的冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率影响显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)显示出好的保护效果;4.第19期和第28期性腺中的EPGCs在相同的冷冻条件下冷冻后,存活率差异不显著(P＞0.05). 结论采用冷冻程序Ⅰ,在10%的DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)的保护下对鸡EPGCs冷冻较为适合.
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胚胎干细胞移植对急性损伤肝脏的作用
目的 探索胚胎干细胞移植在急性损伤肝脏中的存活和分化情况.方法 用四氯化碳(CC14)制备小鼠急性肝损伤模型,将BrdU标记的来源于小鼠原始生殖细胞的胚胎干细胞经静脉移植于模型动物体内,分别于移植后2周、4周取出肝脏,用免疫组织化学、免疫荧光双重染色和PAS染色方法检测移植细胞在受体小鼠肝内的分布、存活、白蛋白的表达和糖原代谢.结果 急性损伤小鼠肝脏可见大量肝细胞空泡样变性,有严重出血现象;2周时损伤肝内可见炎性细胞浸润和未吸收的出血区;4周时仍见少量炎性细胞浸润.干细胞移植2周,肝小叶内可见散在分布的BrdU和ALB双阳性着色细胞,PAS染色呈阳性反应;部分小细胞呈BrdU单阳性着色;损伤移植组的肝小叶结构基本恢复.移植4周,损伤肝小叶结构正常,小的BrdU阳性细胞数量增多.结论 原始生殖细胞可以在急性损伤肝脏中存活,并分化为肝细胞和肝小叶内的其他细胞,并明显改善损伤肝的组织结构.
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子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞
目的探讨子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚原始生殖细胞的可能.方法从5～9周人胚胎生殖嵴、中肾嵴、肠系膜中消化分离原始生殖细胞(PGCs),种植于经丝裂霉素C处理的人子宫内膜基质细胞饲养层上培养.结果PGCs可以在体外培养3个多月,传14代.这样培养的PGCs表达胚胎干细胞的多种标志,如碱性磷酸酶染色、SSEA和TRA抗原等.另外细胞保持正常的染色体核型.结论人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞,保持未分化状态.
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Oct-4和人端粒酶逆转录酶在不同胎龄人胚原始生殖细胞的表达变化
目的 检测不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4、人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达变化.方法 取人胚胎生殖嵴,通过RT-PCR检测5～13周龄人胚生殖嵴中Oct-4、hTERT的表达变化;同时,取人胚胎生殖嵴,经石蜡切片,HE染色、免疫组织化学染色等技术,观察不同胎龄人胚原始生殖细胞的形态,检测Oct-4、hTERT的表达情况.结果 胎龄6～7周时,生殖嵴中可见少量原始生殖细胞,且表达Oct-4及hTERT;胎龄8～12周时,生殖嵴中原始生殖细胞数量增多,Oct-4及hTERT表达增强(P<0.05);胎龄13周以后,生殖嵴中Oct-4阳性的原始生殖细胞数量逐渐减少,Oct-4表达减弱,但hTERT仍然高表达.结论 不同胎龄人胚原始生殖细胞中Oct-4的表达呈动态变化,胎龄8～12周时表达较强,但hTERT的表达量始终维持在较高水平,没有明显变化.
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SSEA-1、Oct-4在人胚胎生殖细胞的表达
目的体外培养人胚胎生殖细胞(EG细胞),通过检测培养的细胞中SSEA-1、Oct-4的表达,鉴定人胚胎生殖细胞.方法取5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养,采用流式细胞术及免疫细胞化学检测培养细胞的SSEA-1、Oct-4表达;取5～9周人胚胎的生殖腺嵴,制备石蜡切片,利用免疫组织化学方法,检测原始生殖细胞的SSEA-1表达.结果组织块体外培养得到的细胞,经免疫细胞化学及流式细胞仪显示的单个细胞或细胞集落,均阳性表达SSEA-1、Oct-4.石蜡切片免疫组织化学显示,人胚胎生殖腺嵴中有许多SSEA-1阳性表达的原始生殖细胞.结论组织块体外培养所获得细胞来源于原始生殖细胞,为未分化的人胚胎生殖细胞.
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小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究
目的探讨小鼠原始生殖细胞(PGC)的体外增殖与分化.方法将PGC与睾丸支持细胞(SC)共培养进行PGC的体外增殖.用原代PGC悬浮培养获取类胚体(EB),将EB贴壁培养,观察自然分化的结果.结果PGC与SC共培养可获得大量PGC集落.组织化学与免疫组织化学法显示,PGC集落碱性磷酸酶(AKP)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)均呈阳性表达.将PGC悬浮培养可获得EB,EB贴壁生长后,可自然分化形成上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.结论小鼠PGC与SC共培养能在体外大量增殖.并保持干细胞特性.PGC可形成EB,EB自然分化后大多数形成神经样细胞、其次是上皮样细胞和成纤维样细胞.
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OCT4在生殖细胞肿瘤的诊断价值
原始生殖细胞具有多向分化的潜能,由其发生的肿瘤形态变化多样,种类较多,如精原细胞瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤和胚胎性癌,然而这些生殖细胞来源的肿瘤容易与一些非生殖细胞来源的肿瘤相混淆.
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卵巢性腺母细胞瘤临床病理分析
卵巢性腺母细胞瘤是一种由原始生殖细胞及性索成分组成的肿瘤,由Scully于1953年首次报道2例并命名.此类肿瘤罕见,我们收治3例性腺母细胞瘤,结合临床资料和文献,探讨其临床病理特征.
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SALL4是一种新的卵巢原始生殖细胞肿瘤标志物
卵巢生殖细胞肿瘤(GCT)主要分为三大类:原始GCT;未成熟畸胎瘤和成熟畸胎瘤;单胚层畸胎瘤和皮样囊肿相关的成人型畸胎瘤.原始GCT是一种罕见恶性肿瘤,GCT包括性腺母细胞瘤、无性母细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎性癌、多胚瘤、非妊娠绒毛膜癌和混合性生殖细胞瘤.卵巢原始GCT有时较难诊断,尤其是易将卵黄囊瘤误诊为透明细胞癌.
