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β-NGF和p75NTR在鼠胚触须隆突区的表达
目的 研究胚胎大鼠触须毛囊隆突区β-神经生长因子(β-NGF)、p75神经营养因子受体(p75NTR)与毛囊干细胞特异标志物的表达规律.方法 冰冻超薄切片,免疫组织化学方法.结果 胚胎大鼠的触须隆突区表达的β-NGF和p75NTn呈规律性变化.3种毛囊干细胞(HFSC)标志物的表达有差异,毛囊发生初期毛囊干细胞(HFSC)不仅仅定位于触须毛囊上段,整个毛囊下部3/4都有表达.结论 β-NGF和p75NTR的表达变化可能与毛囊干细胞以及毛囊的生物学特性有关.
关键词： 大鼠胚胎 触须隆突区 β-神经生长因子 p75神经营养因子受体 -
定向诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞分化的研究
目的探索诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞定向分化的佳条件.方法分离提取小鼠的原始生殖细胞,体外培养扩增后,接种到6孔培养板中.向不同孔中分别加入不同浓度的bFGF、EGF、β-NGF、RA、肝细胞提取液和与胎肝组织分隔培养,进行诱导分化.用靛青绿摄入试验和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、白蛋白(ALB)免疫细胞化学染色鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的状况.结果与胎肝组织分隔培养2 d,可见原始生殖细胞向肝样细胞分化,分化细胞呈圆形和星形,圆形细胞多呈簇状,可以摄入靛青绿呈绿色,并呈AAT和ALB免疫阳性着色,培养12 d时分化率达80%.肝细胞提取液也可诱导原始生殖细胞向肝样细胞分化,12 d时分化率达70%以上;0.5g/L和1 g/L的肝细胞提取液的诱导分化率无显著差异;但是0.5 g/L提取液诱导组圆形细胞较多;而1 g/L肝提取液诱导组,星状分化细胞多.β-神经生长因子(β-NGF)诱导4 d,可见肝样细胞出现,随诱导时间延长,分化细胞增多,圆形分化细胞较多,12 d时分化率达60%以上;20 μg/L和50 μg/L两种浓度的β-NGF诱导分化率无显著差异.bFGF、EGF、RA诱导组未见ALB免疫反应阳性细胞.RA可以增强β-NGF的诱导分化作用,使星状细胞增多明显.结论β-NGF和肝细胞因子可诱导原始生殖细胞向肝细胞定向分化.
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β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用
目的 构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体pLVX-TRE3 G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293 FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响.方法 从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成cDNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体pLVX-TRE3G-IRES中.将重组载体pLVX-TRE3 G-IRES-β-NGF和载体pLVX-Tet3G分别转染空白HEK293 FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组).48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况.同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况.结果 双酶切和测序鉴定重组质粒pLVX-TRE3 G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多.诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白.结论 成功重组慢病毒载体pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白.
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β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用
目的 运用Tet-on3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘于细胞(LSCs)的作用.方法 将pLVX-TRE3 G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293 FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000 μg/L Dox诱导表达组).48 h后收集细胞,免疫印迹法(Westernblotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况.体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、TrkA)的表达情况.结果 NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,TrkA表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,TrkA表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 运用Tet-on3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性.
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β-神经生长因子转染的大鼠内皮祖细胞分化功能的变化
目的 探讨β-神经生长因子(p-NGF)转染的大鼠内皮祖细胞分化功能的变化. 方法 将人β-NGF重组腺病毒(Ad-EGFP-hβ-NGF组)及其阴性对照(Ad-EGFP组)感染至大鼠内皮祖细胞,同时设置空白对照(NC)组,观察细胞形态学改变,Western blot检测不同组酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)表达水平,ELISA法检测不同组培养液中血管内皮生长因子(VEGF)、血管性血友病因子(vWF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)水平. 结果 Ad-EGFP-hβ-NGF感染至大鼠内皮祖细胞1周后可见部分细胞成球,呈干细胞样改变.Ad-EGFP-hβ-NGF组内皮祖细胞TrKA相对蛋白表达水平(0.67±0.23)明显高于Ad-EGFP组(0.20±0.07)及NC组(0.27±0.12)(P＜0.01).Ad-EGFP-hβ-NGF组培养液中VEGF、vWF及bFGF水平明显高于Ad-EGFP组及NC组(P＜0.01). 结论 β-NGF通过激活酪氨酸激酶信号通路,增加促血管生长因子的分泌,促进内皮祖细胞的分化,多途径发挥血管修复和再生的功能.
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电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂和脑梗死体积的影响及其机制探讨
目的 探讨电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂及脑梗死体积的影响,并初步探讨其作用机制.方法 78只SD大鼠随机分为正常组(各n=6),模型组、假手术组、电针1组、电针2组(n=18).除正常组外,其余各组喂养高脂饲料6周制备高脂血症模型.6周后电针1组接受电针双侧"丰隆"穴干预,每天1次,连续7 d.第50天,除正常组外,其余各组大鼠建立大脑中动脉血栓闭塞模型.术后电针1、2组均电针"百会"和双侧"丰隆",每天1次.术后1d检测神经功能和脑梗死体积.术后1、7、14 d检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平;采用免疫蛋白印迹法检测患侧大脑β-NGF和TrkA蛋白表达.结果 术后,模型组TC、TG、LDL升高,HDL降低(P<0.01, P<0.05).与模型组比较,术后7 d电针1、2组TG降低(P<0.01);术后14 d电针1组LDL降低(P<0.05),电针2组差异无统计学意义.与模型组比较,电针1组大鼠神经功能缺损评分(NDS)降低(P<0.05),电针1、2组大鼠左侧大脑梗死体积减小(P<0.01),且电针1组梗死体积小于电针2组(P<0.05).术后1 d,与正常组比较,模型组β-神经生长因子(β-NGF)和络氨酸蛋白激酶(TrkA)表达水平有升高趋势,7 d后恢复至正常;与模型组比较,电针1组β-NGF和TrkA表达水平有升高趋势,并且持续升高至术后14 d.结论 在高血脂阶段针刺干预,可通过调节血脂水平改善脑缺血后大鼠神经功能,减小脑梗死体积,作用优于脑缺血后针刺治疗.其可能的作用机制在于针刺"丰隆"与"百会"穴促进了β-NGF及其受体TrkA的表达.
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川芎嗪与外源性β-神经生长因子对缺氧大鼠海马神经元活性影响的研究
目的:探讨川芎嗪和外源性β-神经生长因子(NGF)对缺氧大鼠海马神经元活性的影响.方法:选取24 h内出生SD乳鼠,进行体外原代培养大鼠海马神经元14 d后分为6组进行相应处理,每组设16个复孔.空白对照组为无细胞生长,每孔加磷酸盐缓冲液( PBS)100 μl;模型对照组每孔加无血清基础培养液100 μl;川芎嗪高、中、低剂量组每孔分别加盐酸川芎嗪注射液4、1和0.25 μl(终浓度分别为800、200和50 mg/L);β -NGF组每孔加含β-NGF终浓度为25 μg/L基础培养液至100 μl .继续培养后在终止培养前2.5 h模拟缺氧环境,以四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测各组缺氧2.5 h后海马神经元活性,测量波长595 nm处的吸光度(A)值.光镜下观察各组海马神经元形态.结果:与模型对照组相比,川芎嗪高剂量组A值显著降低(P＜0.05),川芎嗪中剂量组和β-NGF组显著升高(P均＜0.05),而川芎嗪低剂量组无明显变化(P＞0.05).川芎嗪中剂量组与β-NGF组相比差异无显著性(P＞0.05).光镜下观察 ,随缺氧时间的延长,川芎嗪中剂量组与β-NGF组海马神经元可见不同程度胞体肿大、晕光减弱,以轴突水肿断裂为主,而其他组海马神经元以胞核内容物浓缩甚至胞核破裂、胞质进行性浓缩改变为主.结论:外源性β-NGF与一定剂量范围的川芎嗪具有保持缺氧海马神经元活性的效果,而且川芎嗪的剂量与神经元活性之间存在一定的量-效关系.
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人β-神经生长因子基因重组真核表达载体的构建
目的构建β-神经生长因子(β-NGF)基因重组真核表达载体,为β-NGF基因治疗和临床实验诊断研究打下良好的基础.方法将质粒PGEM-β-NGF进行酶切获得β-NGF基因片段,用T4连接酶将其插入真核表达载体PcDNA3;以T7、P2为引物进行PCR,论证插入片段的方向;经测序和酶切对插入片段进行分析和进一步鉴定.结果 PCR产物琼脂糖电泳结果显示:在预期位置有阳性条带;序列分析和酶切结果证实插入片段序列正确.结论β-NGF基因重组真核表达载体PcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗神经系统疾病和临床实验诊断奠定了基础.
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人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析
目的对人β-NGF基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础.方法本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑cDNA和人睾丸cDNA以及人脑基因组DNA中扩增出β-神经生长因子(β-NGF)基因,并和T4载体相连接,经筛选得到人β-NGF克隆,并用Sanger双脱氧末端终止法进行序列分析.结果凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带.结论阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确.
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脊髓损伤修复的复合透明质酸水凝胶支架的构建及其评价
目的 评价接枝Nogo-66受体(NgR)抗体和多聚左旋赖氨酸(PLL)的透明质酸(HA)水凝胶支架的作用,及转染β神经生长因子(β-NGF)基因的内皮祖细胞(EPCs)能否在支架内稳定表达外源基因.方法 采用冰冻干燥法制备多孔HA水凝胶材料,将NgR抗体和PLL接枝到HA支架上.体外培养EPCs,并通过携带β-NGF腺病毒转染EPCs,将EPCs与支架共培养,通过扫描电镜观察支架结构,将细胞按处理方式及培养方式分为β-NGF+组、Scaffold-β-NGF+组、β-NGF-组、Scaffold-β-NGF-组、对照组和Scaffold-对照组.采用细胞活力(CCK-8)法及HE法检测EPCs在支架上的生长情况,采用乳酸脱氢酶(LDH)-细胞毒性法检测支架的细胞毒性,采用ELISA法、Rt-PCR法和Westem blotting法检测β-NGF的表达.结果 制备的支架具备三维多孔结构,孔径(200±15) μm,大小较均一,EPCs在支架上的生长明显优于培养板中的生长状况(F=468518.044,P＜0.001),且随时间推移,细胞数目差异有统计学意义(F =2678658.138,P＜0.001),支架的细胞毒性相比培养板无明显异常(F=0.680,P =0.429).EPCs在支架上可以稳定表达β-NGF,且Scaffold-β-NGF+组mRNA及蛋白质的表达量均优于β-NGF+组(mRNA:F=651.554,P＜0.001;蛋白:F=14671.733,P＜0.001).结论 EPCs与NgR抗体-PLL复合A水凝胶支架具有良好的生物相容性.该HA水凝胶支架有望作为修复脊髓损伤的组织工程载体.
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人β-神经生长因子前体基因的克隆及序列分析
目的对人β-NGF前体基因的克隆及序列分析,为其在真核细胞中表达并获得具有神经生长因子活性的蛋白及临床应用打下基础.方法从人血白细胞中提取基因组DNA,采用PCR技术,扩增出含前导肽及信号肽的β-NGF前体基因并与PUC18载体连接,经筛选得到重组质粒PUC18-β-NGF,经酶切及序列分析进行鉴定.结果经序列测定与Genebank中已知序列(V01511)相比较,完全一致.结论从人白细胞DNA中获得了人β-NGF前体基因,为神经生长因子的基因治疗提供了条件.
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β-NGF对人翼状胬肉成纤维细胞增生的影响
目的 观察神经生长因子β(β-NGF)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF) 增生的影响,探讨翼状胬肉的发病机制.方法 对翼状胬肉组织标本行组织块培养.待细胞生长汇合至80% 后以0.25%胰蛋白酶+ 0.02%EDTA 1:1 混合消化细胞,取3～5代细胞用于实验.通过细胞中波形蛋白、角蛋白及α平滑肌肌动蛋白的表达鉴定培养的细胞,免疫荧光法检测HPF中β-NGF受体trkA、p75的表达,MTT法检测不同质量浓度β-NGF对HPF的作用,Western blot及RT-PCR法半定量检测细胞核抗原(PCNA)来评估HPF的增生.结果 波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白、trkA和p75在HPF中呈阳性表达;MTT结果显示,在β-NGF 作用12、24、48、72和96h 后,48h为β-NGF促增生的高峰期;在不同质量浓度β-NGF(5～50ng/mL)作用下,HPF中PCNA蛋白及mRNA的表达与0和1ng/mL β-NGF作用组之间比较差异均有统计学意义(F_(protein)=24.980,P=0.000;F_(Mrna)=64.490,P=0.000).结论 NGF可能通过结合两受体trkA、p75促进了HPF的增生.
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β神经生长因子对内皮祖细胞一氧化氮合酶的影响
目的:探讨β-神经生长因子(β-NGF)对大鼠内皮祖细胞(EPCs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及一氧化氮(NO)合成的影响.方法:将β-NGF重组腺病毒(Ad-β-NGF)及其阴性对照感染至大鼠内皮祖细胞,同时设置空白对照,分别于24 h、48 h及72 h进行检测.用qPCR及Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测不同组eNOS表达情况,硝酸还原酶法测定培养液中NO的水平.结果:Ad-NGF感染组eNOS表达及NO合成明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),并随感染时间的延长而增加.结论:β-NGF能促进内皮祖细胞eNOS表达及NO合成,有利于内皮祖细胞发挥功能.
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β-神经生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞功能的影响
目的 研究β-神经生长因子(β-NGF)基因转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对细胞增殖、单克隆形成、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移相关功能的影响.方法 将人源β-NGF基因重组的真核表达质粒(pEGFP-N1/β-NGF)转染至HUVEC,同时设置pEGFP-N1空载组、正常组(未转染质粒)、酪氨酸激酶受体A(TrkA)抑制剂组(β-NGF基因转染组加入1∶1000的K252a).观察转染前后细胞形态学变化,利用real-time PCR和Western blot检测β-NGF基因转染表达效果,MTT法检测β-NGF基因转染对细胞增殖的影响,平板单克隆实验检测β-NGF基因转染对细胞单克隆形成能力的变化,流式细胞术检测β-NGF基因转染对细胞周期和细胞凋亡率的影响,Transwell方法检测转染前后细胞迁移能力的变化,Western blot检测β-NGF基因转染前后TrkA和血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化.结果 β-NGF基因成功转染HUVEC 48 h后能够显著提高β-NGF mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05),同时促进细胞增殖、单克隆形成、细胞迁移能力,并影响细胞周期抑制细胞凋亡率(P＜0.05).β-NGF基因转染HUVEC后TrkA和VEGF表达水平也随之显著上升(P＜0.05),但受到TrkA抑制剂的抑制.结论 β-NGF基因能够成功转染HUVEC并显著表达,进而促进细胞增殖、单克隆形成、细胞迁移能力,并影响细胞周期抑制细胞凋亡率,而其发挥作用与TrkA结合诱导VEGF表达上调有关.
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人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达
目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.
关键词： β-神经生长因子 PCR A-T克隆 Pichia pastons 表达 -
人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
目的构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体,为运用进行基因治疗和细胞移植的研究奠定基础.方法采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-神经生长因子的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和Apa双酶切、纯化、连接、转化及筛选而构建重组载体pcDNA3-β-NGF;经酶切和测序对重组体进行分析和进一步鉴定.结果RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示:在预期位置有阳性条带.重组载体经酶切、测序等分析插人的基因片段为表达β-NGF的基因.结论人β-NGF基因重组真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗脑部疾患、脊髓损伤修复等研究奠定基础.
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脂质体介导人β-神经生长因子基因转染培养肌母细胞的表达研究
目的了解含β-神经生长因子(β-NGF)基因的表达质粒PSVCEP NGF-CAT在培养肌母细胞中的表达及Lipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率.方法将表达质粒PSVCEP NGF-CAT经Lipofect AMINE转染至培养成的肌母细胞中,用免疫细胞化学方法检测基因在肌母细胞内的表达.结果培养肌母细胞在转染6小时吞噬脂质体显著,转染48小时后约40%的肌母细胞胞质内有β- NGF基因表达.结论含β-NGF基因的表达质粒PSVCEP NGF-CAT可以在培养肌母细胞中表达,脂质体转染的方法简便、有效.
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小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
目的:构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3 细胞系中NGF的表达情况. 方法:用基因重组技术,将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列,克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中,用限制性内切酶酶切鉴定重组体.利用脂质体FuGENETM6方法,转染NIH 3T3细胞.转染后72 h,用G418筛选阳性克隆并培养至20 d.对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用.结果:β-NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达.阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长. 结论:重组真核表达载体pcDNA3.1+/NGF构建成功,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达,并具有良好的生物学活性,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础.
