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饲养层分泌碱性成纤维生长因子与支持人胚胎干细胞生长
目的 初步探讨人源性和鼠源性饲养层细胞分泌的碱性成纤维生长因子(bFGF)对人胚胎干细胞(hESCs)未分化生长的影响. 方法 人源性和鼠源性成纤维细胞制备成饲养层(人源性饲养层不加bFGF,鼠源性饲养层加4ng/ml bFGF),同期接种同一株hESCs,对比hESCs的贴壁率、克隆生长率及未分化率,比较它们支持hESCs生长的差异;通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,快速检测评估人源性和鼠源性饲养层细胞自身分泌的bFGF. 结果 人包皮和鼠源性饲养层培养hESCs的贴壁率和克隆生长率之间无显著差异(P＞0.05),但是鼠源性支持三代hESCs的未分化率均高于人源性饲养层(P＜0.05).鼠源性饲养层不能分泌任何可测量到的bFGF,而人源性饲养层细胞均能分泌bFGF. 结论 饲养层细胞自身分泌的bFGF能支持hESCs的贴壁和增殖生长,但不同饲养层支持hESCs生长的适宜bFGF浓度和抑制hESCs分化的作用机制,还有待于进一步研究.
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人胎肺成纤维细胞对小鼠胚胎干细胞生长支持作用的研究
目的 探讨人胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层支持小鼠胚胎干细胞(ES)的生长及维持ES细胞的未分化状态.方法 采用生长状态良好的hELF,经一定浓度的丝裂霉素C处理后,制备hELF饲养层,将ES细胞接种到该饲养层进行传代培养.观察ES细胞的形态学特征,测定ES细胞表面碱性磷酸酶(AKP)活性、干细胞标志物Oct-4的表达.结果 hELF细胞经丝裂霉素C处理后不再增殖,保持较好的细胞功能和形态学特征.ES细胞克隆在饲养层呈现集落状隆起生长,边缘清楚,结构致密,与周围的饲养层细胞界限清楚.ES细胞仍然保持未分化状态,高度表达AKP及胚胎干细胞转录因子Oct-4.结论 hELF作为饲养层可以较好的维持胚胎干细胞的生长及其未分化状态.hELF源自人工流产组织,取材来源较丰富,为hELF饲养层应用于人胚胎干细胞的培养奠定了基础.
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以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究
目的:研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据.方法:取7～8d的SD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞.以二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞.结果:用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性.结论:冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型.
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信号通路抑制剂和饲养层对猪胚胎生殖细胞建系的影响
胚胎生殖细胞(EGCs)是原始生殖细胞(PGCs)在体外特定条件下,经重编程而形成的、具有和胚胎干细胞(ESCs)相似特性的多能性干细胞.猪EGCs的研究在利用EGCs进行核移植、生产转基因动物以及建立生物反应器方面具有广阔的应用前景.然而到目前为止真正意义上的猪EG细胞系还没有建立,体外培养条件不确定是影响猪EGCs建系的重要因素之一.本研究探讨了猪PGCs体外培养过程中不同信号通路抑制剂以及不同饲养层对其重编程形成EGCs的影响,确定了CHIR99021、SB431542和小鼠成纤维细胞制作的饲养层组合,能够较大程度维持PGCs的增殖及存活能力,实现向EGCs的重编程.
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小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养及饲养层制备
目的 建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层,用于胚胎干细胞的培养.方法 取孕13～ 15d的昆明种小鼠,分离原代成纤维细胞,在37℃时,用0.25％胰蛋白酶(含0.04％ EDTA)消化组织块5min,重复消化多次,24h首次换液,培养3d后传代.采用10μg/mL丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞3h,制备出的饲养层细胞能有效地抑制胚胎干细胞的分裂,且不影响其活力.结果 胎鼠分离原代成纤维细胞经10μg/mL丝裂霉素C处理后,细胞仍保持分泌多种生长因子的能力,在10d内既不增殖,也不死亡,能够很好的维持胚胎干细胞克隆的生长.结论 该方法制备的饲养细胞层适用于胚胎干细胞的培养.
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人脐静脉内皮细胞饲养层促进胚胎干细胞的生长
目的 探讨人脐静脉内皮细胞是否可作为饲养层支持胚胎干细胞(ESCs)的生长.方法 分离培养人脐带内皮细胞,采用生长良好的3代内皮细胞,灭活后制备饲养层,通过观察碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)体内畸胎瘤形成实验,对在内皮细胞上的E14.1胚胎干细胞进行鉴定.结果 E14.1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶、SSEA.1及Oct-4.传15代后仍表现正常的二倍体核型.传20代的ESCs接种到SCID小鼠,6周后均能形成畸胎瘤.结论 人脐静脉血管内皮细胞能有效地支持ESCs的生长,解决了ESCs临床应用的生物安全性问题.
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人成纤维细胞饲养层促进人角朊细胞生长
目的 探讨人成纤维细胞(HFB)是否可作为饲养层支持人角朊细胞(KC)的生长.方法 分离培养人真皮FB,用丝裂霉素C处理制成饲养层,应用RT-PCR、免疫细胞化学染色方法检测Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原蛋白的表达;在FB饲养层上接种人KC,观察其促进KC贴壁、生长、移行及分化的作用;并设置NIH3T3细胞饲养层为对照组,在其上接种人KC,观察KC贴壁数和膜片完全融合时间.结果 FB饲养层Ⅰ型前胶原mRNA的表达有所增加(P＜0.05)、Ⅲ型前胶原mRNA的表达无明显变化,抗Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白抗体阳性;以适宜密度接种的成纤维细胞饲养层,KC贴壁、生长和分化良好;二种饲养层KC贴壁数和膜片完全融合时间无差异.结论 人真皮FB饲养层能够分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原,促进人KC生长并形成复层细胞.
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以转染白血病抑制因子基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞
目的 以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础.方法 将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LIF的阳性细胞.将原始生殖细胞(PGCs)种植到转染后细胞制备而成的饲养层上,在不添加外源性LIF的条件下培养,并对PGCs来源的细胞集落进行鉴定.结果 经RT-PCR及Western blotting 鉴定证实,转染pcDNA3.1(+)-LIF的人胚肺成纤维细胞表达LIF基因.在转染后人胚肺成纤维细胞上生长的PGCs可形成典型的鸟巢状集落,经检测集落碱性磷酸酶活性呈强阳性,表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,及未分化标志Oct-4.结论 用转染LIF基因后的人胚肺成纤维细胞作为饲养层能支持PGCs来源人胚胎生殖细胞的生长,维持自我更新.
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新生昆明小鼠睾丸支持细胞和精原细胞的共培养及支持细胞的作用
目的 分离、纯化、培养小鼠睾丸支持细胞,通过与精原细胞共培养,研究体外培养的支持细胞对精原细胞的影响.方法 用复合酶消化、密度梯度离心和差异贴壁法分离、纯化、培养新生小鼠睾丸支持细胞,以苏丹Ⅳ染色鉴定支持细胞;用丝裂霉素-C处理支持细胞后作为饲养层,与精原细胞共培养;以直接分离培养的精原细胞作对照.倒置相差显微镜观察,细胞培养第3天,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定精原细胞的增殖率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/磷脂酰肌醇(ANNEXIN-V-FITC/PI)染色;激光扫描共焦显微镜观察记录精原细胞的凋亡率,比较精原细胞克隆大小、存活时间、增殖率和凋亡率的不同. 结果 分离、纯化后经苏丹Ⅳ染色鉴定的小鼠支持细胞纯度可达95%以上,与支持细胞共培养的精原细胞的克隆大小、存活时间和细胞增殖率明显高于对照组,而凋亡鲻率则明显低于对照组.结论支持细胞可以促进精原细胞的增殖,抑制其凋亡.
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小鼠胚胎干细胞与复合丝素膜的生物相容性研究
探索胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性,建立一套在丝素膜上小鼠胚胎干细胞的体外培养体系.通过形态观察、MTT比色法、克隆形成率分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、核型分析等方法,研究丝素膜对小鼠胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、遗传、分化等方面的影响.结果显示,两者之间具有良好的生物相容性,丝素膜材料支持小鼠胚胎干细胞的体外无限扩增和未分化特征,并保持其正常核型.证实丝素材料可作为胚胎干细胞结合的良好生物材料.
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不同饲细胞对维持角膜缘干细胞未分化状态的方法
角膜缘干细胞体外扩增后用于组织工程角膜移植,可成功治疗多种原因引起的角膜缘干细胞缺乏症,由于角膜缘干细胞在体外培养过程中数量少且容易分化,寻找一种理想的饲养层与其共培养以达到扩增角膜缘干细胞的目的成为目前的研究热点.本文将就目前各饲养层的制备、机制等方面的研究进展做一综述.
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饲养层与干细胞的体外培养
干细胞的体外培养要求在保持其未分化状态的同时,还要保持其旺盛的分裂增殖能力,所以在原代或初期培养时,干细胞的体外培养依赖饲养层细胞及其分泌的生长因子,饲养层细胞一方面可促进胚胎干细胞的附着,另一方面可分泌一些促干细胞增殖并抑制其分化的细胞因子,不同实验室在体外培养干细胞过程中所使用的饲养层细胞有所不同,故在此予以综述.
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用于胚胎干细胞分离培养的饲养层的制作
饲养层对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)的培养与建系十分重要.实验选择小鼠原代成纤维细胞(Primary mouse embroy fibroblasts,PMEF)作为饲养层,这种饲养层能够较好地维持ES细胞未分化状态和二倍体核型.除选用经典的14.5 d的孕鼠制做原代成纤维细胞外,我们还选了10 d、18 d、的孕鼠制成饲养层,通过ES-D3的传代培养结果表明:10～18 d的PMEE均可作为饲养层用,10代内的饲养层培养细胞均适宜.
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潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立
目的 建立具有潮霉素(hygromycin)抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层.方法 通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段(5.1 kb)导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内.结果 共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达.结论 成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件.
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胚胎干细胞途径获得基因工程小鼠的原理与方法
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell简称ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass, MIS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能.在饲养层上或含有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)或分化抑因子(Differentiation inhibitory activity DIA)的培养基中培养时保持未分化状态,但在适当条件下被诱导分化.在这种细胞注入受体胚胎时,能参与各种组织器官发育,形成嵌合体[1～4].
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胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响
目的 探讨由胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)诱导的内皮细胞(endothelial cells,Ec)与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响.方法 提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组.A组:胚胎干细胞诱导组;B组:胚胎干细胞诱导组;C组:胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞(Ec)诱导组;D组:ESCs和诱导的EC联合培养诱导组.通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响.结果 通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC.D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义(p＞0.05),骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组(p＜0.05).结论 以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用.
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人胚胎干细胞培养体系的研究进展
人胚胎干细胞(hES细胞)是来源于着床前人囊胚内细胞团的、具有自我更新能力和分化全能性的细胞.由于具有体外无限增殖和分化成三个胚层来源的各种细胞的潜能,hES细胞具有重要的科学意义和巨大的医学应用价值.目前,hES细胞常规体外培养技术多采用培养基与饲养层相结合的方法,但常规方法存在异源病原体污染的可能.近年来,优化hES细胞体外培养体系的研究取得较大进展,现就饲养层、无饲养层培养体系进行综述,分析目前在维持hES细胞未分化状态的优化培养研究中取得的新进展和存在的问题.
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人胚胎干细胞饲养层培养体系的研究进展
人胚胎干细胞(hES细胞)来源于着床前人囊胚内细胞团(ICM),由于具有体外无限增殖和分化成3个胚层来源的各种细胞的潜能,使其成为当今生命科学的研究热点.建立一个理想的hES细胞培养体系是利用它的前提.目前,常用的hES细胞的体外培养方式是将其培养在饲养层细胞上.迄今为止,已经有多种细胞用于hES细胞的体外培养.饲养层的存在不仅为hES细胞的生长繁殖提供了一个稳定的外环境,同时也维持了hES细胞无限增殖与分化的特性；然而衰老的、不合适的饲养层会对hES细胞产生负面影响.对不同来源的饲养层细胞作一综述,比较不同种类的饲养层细胞的优缺点,旨在为将来的研究提供借鉴.
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大鼠精原干细胞培养饲养层的制备
目的：通过分离和培养 BALB/ C 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),制备用于大鼠精原干细胞(SSCs)培养的饲养层。方法从胎龄为12.5~14.5 d 的胎鼠中分离 MEF,经不同浓度(5、10、15 mg/ L)丝裂霉素 C 处理不同时间(1.5、3、4.5 h),应用噻唑蓝(MTT)法测定其增殖活性。将大鼠 SSCs 接种到佳饲养层上培养,观察细胞生长情况。结果从胎龄为12.5~14.5 d 的胎鼠中分离培养的 MEF 数量多,增殖快。常温下,经0.25%胰酶(含0.04% EDTA)处理2~3 min 细胞增殖状况良好。经10 mg/ L 丝裂霉素 C 处理3 h MEF 增殖不明显,与0 d 比较差异无统计学意义(P >0．05)。结论12.5~14.5 d 是分离培养小鼠 MEF 的佳胎龄,10 mg/ L 丝裂霉素 C 作用3 h 对 MEF 的增殖具有良好的抑制作用,有利于大鼠 SSCs 的培养。
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不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖分化的影响
目的:研究不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖的影响.方法:利用人的骨髓基质细胞(BMSC),皮肤成纤维细胞(SFB)及脐静脉内皮细胞株(ECV304)作为细胞饲养层,分别与HL-60白血病细胞株共培养5d,行细胞分类、计数检测HL-60细胞株的增殖分化情况.结果:BMSC及SFB饲养层均能抑制HL-60细胞株的增殖并促进其分化,BMSC略优于SFB饲养层,而ECV304细胞饲养层却无明显的促分化的作用,第五天才出现较弱的抑增殖作用.结论:BMSC及SFB饲养层能有效抑制HL-60癌株,可能是通过细胞与细胞间的接触或细胞因子、因素的近距离调节所致,ECV304该项能力较弱.
